Understanding T-cell triggering under different in vitro conditions

Abstract

T cells play an important role in the immune system where T cell receptors (TCR) identify foreign pathogens bound to major histocompability complex (MHC) molecules on antigen presenting cells (APCs). The detection of an antigen causes the T cell to trigger, which is an activation of the cell that results in a cellular immune response. This triggering process is not fully understood and studying the T cells in vivo is difficult due to the sheer amount of interactions between the hundreds of different proteins on the cell surface. This is circumvented by studying the cells in vitro on a supported lipid bilayer (SLB) which resembles a cell membrane of an opposing cell. In this thesis the interactions between T cells and bilayers of different lipid compositions were studied, where all different surfaces produced triggered cells. Surprisingly, the antibody OKT3 had the lowest number of triggering cells whereas the bilayers with 1%, 2% and 5% of the lipid DGS-NTA produced the highest number of triggering cells independent of the percentage. However, the OKT3 coated surface caused the quickest triggering whereas the other surfaces had slower but similar triggering times. The interaction between cells and membrane proteins are studied by binding membrane proteins to an SLB and adding cells. Next in this thesis, the T cell protein rat CD2 was non-covalently bound to an SLB, where the detachment of the protein was measured over time in different buffer mixtures to observe whether the buffers had an effect on the bound protein. The RPMI media had the highest influence on the detachment of protein. The FBS component of RPMI media stopped rat CD2 from binding to the bilayer but did not influence the detachment of the proteins that successfully bound to the bilayer. In the last experiment the interaction between T cells and rat CD2 bound to an SLB was studied. It was known that the cells would trigger when binding to the CD2 but not how much of the protein is needed for triggering. The protein accumulated under the cell after binding to non-native rat CD48 on the cell surface. The cells were triggered both before and after visible protein accumulations on the bilayer and therefore it could not be concluded whether a certain level of protein accumulation was necessary for the cells to trigger.

Popular Abstract (Swedish)

När vi drabbas utav bakteriella infektioner agerar immunförsvaret kvickt för att utrota dessa elakingar som orsakar sjukdomar. De kanske mest kända försvararna är de vita blodkropparna, olika celler som upptäcker och utrotar hot. T-cellen, vars namn kommer från engelskans Thymus (brässen, ett litet organ i bröstkorgen) är delvis ansvariga för upptäckandet av hoten. T-cellen har en receptor kallad TCR som identifierar hoten och binder till den infekterade cellen. När en T-cell upptäcker en infekterad cell sker det en mängd interna reaktioner i cellen som leder till aktivering av hela försvarsarmén. Den huvudsakliga händelsen är att TCR får en massa fosfatmolekyler på sig som signalerar om att ett hot är upptäckt. Denna signalering kallas för triggning av cellen och är inte helt förstådd än, men är av stort intresse för forskning kring autoimmuna sjukdomar där friska celler identifieras som infekterade. Det finns olika modeller som föreslår hur för triggning fungerar, varav Kinetic Segregation (KS) modellen som anses vara korrekt i denna tes. Det finns ett stort protein som plockar bort fosfatgrupper från TCR och hindrar triggning, och när T-cellen binder till en infekterad cell antas det att proteinet puttas bort vilket låter cellen triggas. Detta har visats experimentellt i en studie av Chang et al (2016) där man band ihop T-celler till ett låtsascellmembran med två små proteiner och såg att cellerna triggades. Låtsasmembranet består av ett bilager (dubbelt lager) av fettliknande molekyler kallade lipider som härmar cellytor.

I och med att bilager används vanligen för att studera cellers interaktioner med proteiner så var det av intresse att testa om olika bilager kunde orsaka triggning av T-celler. I detta projekt användes lipiderna POPC och DGS-NTA, varav den sistnämnda kan binda till andra molekyler. Koncentrationerna som testades var 1%, 2% och 5% DGS-NTA. Dessa tre bilager orsakade lika mycket triggning oavsett koncentration. Andel triggade celler kunde variera mycket från dag till dag, vilket troligtvis berodde på att cellerna är olika friska beroende på när de t.ex. blir matade. I nästa del av projektet upprepades en version av Chang et al experiment med proteinet CD2 bundet till ett 5% DGS-NTA bilager för att testa huruvida mängden CD2 under T-cellerna spelade roll för när cellerna skulle triggas. Vad som observerades var att cellerna triggades oavsett mängd CD2 under cellerna och något sammanband kunde inte hittas. En viktig detalj med proteinet CD2 är att det är inte permanent bundet utan kan lossna från bilagret. Om proteinet lossnar under experiment när man studerar interaktioner mellan cell och protein kan resultatet påverkas. I den tredje delen av projektet testades hur mycket CD2 som lossnade från ett 5% DGS-NTA bilager i olika bufferlösningar, varav två av dessa innehöll näringsämnen som salter och socker som cellerna lever av. Cellmedium som innehöll alla näringsämnen orsakade sju gånger större förlust av proteiner från bilagret än bufferten utan näringsämnen. Den tredje buffertlösningen innehöll en komponent utav cellmediet, där den som väntat hindrade proteinerna från att binda till bilagret, däremot kunde inte någon förlust av proteiner mätas. Detta var oväntat med tanke på att de hindrade CD2 från att binda till bilagret och bör på samma sätt ha orsakat proteinerna att lossna.

Sammanfattningsvis så kunde det observeras att lipidbilager triggade T-celler lika mycket, cellmedia orsakade stor förlust av proteiner bundna till bilager samt att något sammanband mellan mängd CD2 och triggande celler kunde ej hittas. Detta resultat gav inte mer information om hur triggning fungerar, men det visade att det spelar ingen roll vilken koncentration på bilagret man har när man studerar interaktioner mellan celler och proteiner.

• author: Fuentes, Amélie
• supervisor: Victoria Junghans
• organization: Department of Chemistry
• course: KEML07 20182
• year: 2019
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Chemistry
• keywords: Physical chemistry, Biophysics, T cell, Supported lipid bilayer, membrane protein, fysikalisk kemi
• language: English
• id: 8968835
• date added to LUP: 2019-02-28 08:29:24
• date last changed: 2019-02-28 08:29:24