The anti-amyloidogenic activity in the chaperone DNAJB6 and mimic constructs with only the most conserved serine and threonine rich beta-hairpin
(2021) KEML10 20211Department of Chemistry
- Abstract
- The chaperone DNAJB6 can suppress fibril formation of amyloid-β. This is dependent on functionally important conserved serine (S) and threonine (T) residues located in a C-terminal domain which is dominated by β-strands. Substitution of the conserved ST-residues with alanine residues results in loss of this function. In this thesis two DNAJB6 mimic constructs are examined to see whether or not they also can suppress fibril formation. The purified DNAJB6 mimic constructs were created by molecular genetics methods to contain a minor part of the DNAJB6 protein, the conserved ST-residues that are located in a β-sheet motif. One construct had only the most conserved ST-residues in one 1.5 kDa β-hairpin, that was grafted to calbindin for... (More)
- The chaperone DNAJB6 can suppress fibril formation of amyloid-β. This is dependent on functionally important conserved serine (S) and threonine (T) residues located in a C-terminal domain which is dominated by β-strands. Substitution of the conserved ST-residues with alanine residues results in loss of this function. In this thesis two DNAJB6 mimic constructs are examined to see whether or not they also can suppress fibril formation. The purified DNAJB6 mimic constructs were created by molecular genetics methods to contain a minor part of the DNAJB6 protein, the conserved ST-residues that are located in a β-sheet motif. One construct had only the most conserved ST-residues in one 1.5 kDa β-hairpin, that was grafted to calbindin for possible stabilization, yielding a 11.6 kDa construct. Another construct without such grafting contained the whole ST-containing β-sheet motif and the most C-terminal part of DNAJB6 included for assumed stabilization, yielding a 6.3 kDa construct. The method used to determine suppression of fibril formation by Aβ42 was suppression of Thioflavin T fluorescence increase. The results showed that both constructs had a small anti-amyloidogenic activity but only at concentrations higher than 3 μM, compared to DNAJB6 chaperone that shows anti-amyloidogenic activity at tenfold lower concentration such as 0.3 uM. To assure that the observed effect was not unspecific, constructs with alanine substitution of the conserved ST residues were purified and used for kinetic analysis. We conclude that both constructs show a very small anti-amyloidogenic effect that is dependent on the ST-residues. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- Proteiner som hjälper andra proteiner att bevara deras struktur genom att binda in till dem kallas chaperoner. Chaperonet DNAJB6 (se figur nedan) finns bland annat i människokroppen och hjälper till att hindra vissa aggregeringsbenägna peptider, som amyloid-β, från att aggregera till fibriller. Fibriller av amyloid-β är kopplade till neurodegenerativa sjukdomar så som Huntington och Alzheimer. I fallet för Alzheimers så är det fibriller av amyloid-β som är 42 aminosyror lång och kallas för Aβ42. En specifik aminosyrasekvens i DNAJB6 som innehåller aminosyrorna serin (S) och treonin (T) har betydelse för att förhindra fibrillerna att bildas och hindra neurodegenerativa sjukdomar. Aminosyrorna S och T är båda polära eftersom de har en... (More)
- Proteiner som hjälper andra proteiner att bevara deras struktur genom att binda in till dem kallas chaperoner. Chaperonet DNAJB6 (se figur nedan) finns bland annat i människokroppen och hjälper till att hindra vissa aggregeringsbenägna peptider, som amyloid-β, från att aggregera till fibriller. Fibriller av amyloid-β är kopplade till neurodegenerativa sjukdomar så som Huntington och Alzheimer. I fallet för Alzheimers så är det fibriller av amyloid-β som är 42 aminosyror lång och kallas för Aβ42. En specifik aminosyrasekvens i DNAJB6 som innehåller aminosyrorna serin (S) och treonin (T) har betydelse för att förhindra fibrillerna att bildas och hindra neurodegenerativa sjukdomar. Aminosyrorna S och T är båda polära eftersom de har en hydroxylgrupp (OH-grupp) i sin sidokedja. En hypotes är att aminosyrornas hydroxylgrupp binder till oligomera former av amyloid-β och därmed förhindrar att fibrillerna bildas.
I detta arbete har två konstrukt, som innehåller delar av aminosyrasekvensen med ST-residuer som finns i DNAJB6 protein, undersökts om de har en liknade effekt på amyloid-β. Konstrukten har tillverkats med molekylärgenetisk teknik och skiljer sig åt i både storlek och struktur. Det ena konstruktet som har strukturen av en β-hårnål och är 1.5 kDa stort (figur b), och eftersom det är så litet har det för att stabiliseras sammanfogats med ett hjälp-protein, calbindin. Det andra konstruktet innehåller en större del av DNAJB6, på 6.3 kDa (figur c). Det innehåller två β-hårnålar som bildar ett β-flak och de sista 10 aminosyror bildar en alfa-helix vilket tillsammans utgör den C-terminala domänen av DNAJB6.
För att undersöka konstruktens effekt på Aβ42 har Thioflavin T (ThT) fluorescensanalys använts. Metoden bygger på att ThT ökar i fluorescens när Aβ42 aggregerar till fibriller. I fluorescensanalysen var konstrukten närvarande i koncentrationer varierande från 0–6 μM tillsammans med ThT och 3 μM Aβ42. Data hämtad från experimentet kunde därefter plottas till grafer som visar sigmoidala kurvor (kurvor med S form) med tid på x-axeln och ThT fluorescensintensiteten på y-axeln. För att utvärdera om effekten som konstrukten hade var kopplad till ST-residuerna användes kontroller i form av alaninsubstituerade mutanter av konstrukten. Resultaten från experimenten visade att båda konstrukten hade en inhiberande effekt på Aβ42 vid koncentrationer över 3 μM, men betydligt mycket mindre jämfört med det hela proteinet DNAJB6 som visade en inhiberande effekt vid 0.3 μM.
Sammanfattningsvis drar vi den slutsatsen att även om ST-regionen är viktig för förmågan hos DNAJB6 att förhindrar aggregering så är inte ST-regionen i sig tillräcklig för full funktion. Vad det beror på är svårt att säga. Nästa steg hade kunnat vara att utvärdera om ST-regionen i konstrukten överhuvudtaget har kvar förmågan att binda Aβ42, även om de som vi här sett inte är lika effektiva som DNAJB6 i att stoppa aggregering. Fortsatta studier behövs för att förstå varför DNAJB6 är så effektivt i att stoppa bildning av amyloida Aβ42 fibriller och kanske utnyttja kroppens egen förmåga att förhindra Alzheimers sjukdom och andra neurodegenerativa sjukdomar. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9049439
- author
- Karlsson, Maja LU
- supervisor
- organization
- course
- KEML10 20211
- year
- 2021
- type
- M2 - Bachelor Degree
- subject
- keywords
- DNAJB6, Amyloid-beta, Mimic constructs, Biochemistry
- language
- English
- id
- 9049439
- date added to LUP
- 2021-06-16 10:22:11
- date last changed
- 2021-06-16 10:22:11
@misc{9049439,
abstract = {{The chaperone DNAJB6 can suppress fibril formation of amyloid-β. This is dependent on functionally important conserved serine (S) and threonine (T) residues located in a C-terminal domain which is dominated by β-strands. Substitution of the conserved ST-residues with alanine residues results in loss of this function. In this thesis two DNAJB6 mimic constructs are examined to see whether or not they also can suppress fibril formation. The purified DNAJB6 mimic constructs were created by molecular genetics methods to contain a minor part of the DNAJB6 protein, the conserved ST-residues that are located in a β-sheet motif. One construct had only the most conserved ST-residues in one 1.5 kDa β-hairpin, that was grafted to calbindin for possible stabilization, yielding a 11.6 kDa construct. Another construct without such grafting contained the whole ST-containing β-sheet motif and the most C-terminal part of DNAJB6 included for assumed stabilization, yielding a 6.3 kDa construct. The method used to determine suppression of fibril formation by Aβ42 was suppression of Thioflavin T fluorescence increase. The results showed that both constructs had a small anti-amyloidogenic activity but only at concentrations higher than 3 μM, compared to DNAJB6 chaperone that shows anti-amyloidogenic activity at tenfold lower concentration such as 0.3 uM. To assure that the observed effect was not unspecific, constructs with alanine substitution of the conserved ST residues were purified and used for kinetic analysis. We conclude that both constructs show a very small anti-amyloidogenic effect that is dependent on the ST-residues.}},
author = {{Karlsson, Maja}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{The anti-amyloidogenic activity in the chaperone DNAJB6 and mimic constructs with only the most conserved serine and threonine rich beta-hairpin}},
year = {{2021}},
}