Expression and Function of Human and Plant Aquaporins

Abstract

The aquaporins (AQPs) belong to a family of water permeable membrane channels found in virtually all living organisms. Thirteen isoforms of mammalian AQPs are found, whereas in Arabidopsis thaliana 35 genes encoding AQPs are found. The AQPs are distributed in different organs, cell types and in different subcellular membranes. The aquaporins form homotetramers where each monomer functions as an independent pore. In addition to water, some aquaporins are permeable to other small solutes, such as glycerol, urea, H2O2 and NH3.

The objective of the work described in this thesis is to increase the knowledge of expression and function of human and plant aquaporins. Human AQP8 and AQP5 were heterologously expressed in Pichia pastoris. The proteins were purified and reconstituted into proteoliposomes to verify the functionality and were subsequently crystallized. The 2-D crystals of human AQP8 were analyzed by electron diffraction and diffracted to 3 Å, whereas the 3-D crystals of human AQP5 were analyzed by X-ray crystallography resulting in a high-resolution structure of 2.0 Å. A large amount of pure protein is needed in order to be able to crystallize a protein. Therefore, a method was developed to screen for multi-copy P. pastoris clones expressing selected aquaporins at a high level. The number of gene copies was verified by quantitative PCR and for each isoform it was correlated to the aquaporin protein expression level, although there is a large variation in expression between isoforms with the same copy number. Many aquaporins are known to be regulated at a post-translational level. Based on the high-resolution structure of the plant SoPIP2;1, we wanted to explore amino acid residues involved in stabilizing the open or closed conformation of the protein. The mutations we made were located in the D-loop, known to be involved in the gating mechanism of SoPIP2;1, or immediately after the D-loop. The mutant proteins were expressed in Xenopus laevis oocytes to determine their water transport rate. We identified several amino acid residues involved in stabilizing an open conformation or a closed conformation. In order for maintaining water homeostasis in chloroplasts and in order for the light-dependent photosynthetic reaction to occur, water needs to be transported into the chloroplast and into the thylakoid lumen. Arabidopsis chloroplast membranes were analyzed by immunoblots and mass spectrometric analysis to elucidate the aquaporin isoforms present in the chloroplast membranes. We identified the PIP2;1 isoform, one or several PIP1 isoforms and the TIP2;1 isoform in the thylakoid membranes, and the PIP2;1 isoform and the TIP2;1 isoform in the inner envelope membranes.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

En cell är den minsta beståndsdelen av det som vi definierar som liv. Cellen avgränsas av ett cellmembran som gör att rätt miljö, dvs rätt koncentration av alla nödvändiga molekyler, upprätthålls inuti cellen. Cellmembranet består bl a av olika slags fett, sk lipider. Många små molekyler kan fritt passera igenom membranet medan andra kräver specifika transportkanaler i membranet och dessa kanaler utgörs av proteiner. Dessa membranproteiner fungerar som grindvakter för cellen. Inuti cellen finns flera membranomslutna strukturer och på grund av sitt membran kan dessa ha olika interna miljöer vilket behövs för de olika reaktionerna i cellen.

Vatten är en livsviktig molekyl för alla levande organismer och behövs i många fysiologiska funktioner. Celler omges av vatten men i kroppen utgörs den största mängden vatten av det som finns inuti cellen. Länge trodde man att vatten passerar över membranet enbart via diffusion. I slutet av 1980-talet upptäcktes ett protein av en slump i röda blodkroppar, ett protein som sitter i cellmembranet och bildar en kanal. Senare fann man att detta protein är selektivt permeabelt för vatten och gavs namnet aquaporin 1 (AQP1). Numera vet man att aquaporiner finns i alla levande organismer, från människa till bakterie. År 2003 delades Nobelpriset i kemi ut till Peter Agre för upptäckten av AQP1 och efter detta har intresset ökat för forskningen kring aquaporinerna och hur de fungerar, både inom grundforskningen och inom tillämpad forskning. AQP1 identifierades som en enbart vattentransporterande kanal. Nu vet man att flera medlemmar i aquaporinfamiljen även kan transportera andra molekyler. Trots att vatten kan diffundera över cellmembranet så gör aquaporinerna att vatten på ett mer effektivt sätt kan transporteras in och ut ur celler i de vävnader som kräver en snabb vattentransport.

Människan har 13 varianter av aquaporiner (AQP0-12) och dessa finns i alla typer av vävnader i kroppen. Flera aquaporiner har sin specifika vävnadslokalisering, t ex i ögonen, njurarna, mag- tarmkanalen och huden. Om man har en förändring, en mutation, i den genen eller helt saknar den genen som kodar för en specifik aquaporin kan vissa sjukdomar uppstå.

Målet med denna avhandling var att öka förståelsen för aquaporinernas funktion genom att studera dem i jästceller, Pichia pastoris, och i ägg från grodan Xenopus laevis, samt deras vävnadslokalisering i växtcellens kloroplast. Genom att genmodifiera Pichia pastoris så att den producerar den specifika aquaporinen vi vill studera, kan proteinet renas fram och sedan kristalliseras för att dess struktur på atomnivå ska kunna studeras (Paper I och II). För att kunna kristallisera ett specifikt protein behövs stora mängder av enbart detta protein. I Paper III utarbetade vi en metod för hur vi kan selektera dessa modifierade jästceller som bär på flera kopior av den gen som kodar för den specifika aquaporinen. En jästcell med flera kopior av den specifika aquaporin-genen kan potentiellt producera vår aquaporin med ett högre utbyte per jästcell.

Tidigare har man lyckats få fram atomstrukturen på en spenataquaporin, SoPIP2;1. Det arbetet ledde fram till att man upptäckte en mekanism för hur aquaporinen kan regleras genom att öppnas och stängas när det utsätts för olika miljöer, såsom torka eller översvämning. Med denna kunskap som bakgrund var målet med Paper IV att mutera, dvs byta ut vissa av proteinets byggstenar de sk aminosyrorna, så att SoPIP2;1 låses i ett konstant öppet respektive stängt läge. För att kunna se om vattentransporten ökar eller minskar i dessa muterade aquaporiner, jämfört med den icke-muterade, så injicerar man den gen som kodar för dessa spenataquaporiner i grodägg från Xenopus laevis. Dessa grodägg har naturligt väldigt låg permeabilitet för vatten. Genom att grodägget får producera aquaporinen och att det lokaliserar till dess cellmembran förändras vattenpermeabiliteten och blir mätbar när man placerar grodäggen i en lösning som är mer utspädd än vad lösningen på insidan av grodägget har. För att utjämna koncentrationsskillnaden mellan in- och utsida passerar vatten in i grodägget via aquaporinen och till slut spricker ägget. Händelseförloppet filmas och hastigheten av vattentransporten jämförs mellan de grodägg som har producerat den muterade respektive icke-muterade aquaporinen. På så vis kan vi få reda på om mutationen bidrog till en ökad eller minskad vattentransport genom att aquaporinen låses i ett öppet respektive stängt läge. I Paper V ville vi undersöka om vi kunde hitta aquaporiner i växtens kloroplast. En kloroplast är en membranomsluten struktur inuti växtcellen som omvandlar vatten och koldioxid till socker och syrgas genom ljusenergi från solen, den sk fotosyntesen. Eftersom vatten behöver transporteras in i kloroplasten för att fotosyntesen ska fungera, ville vi undersöka om aquaporiner finns i kloroplaster och studera vilka varianter av aquaporiner som finns i de olika delarna av kloroplastens membran.

• author: Agemark, Maria
• supervisor: Per Kjellbom
• opponent: Dr Bill, Roslyn, Aston University, Aston Triangle, Birmingham, B4 7ET, United Kingdom
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2011
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: aquaporin, water channel, overexpression, Pichia pastoris, AQP8, AQP5, SoPIP2, 1
• pages: 188 pages
• defense location: Lecture hall B at the Center for Chemical Engineering
• defense date: 2011-06-10 10:15:00
• ISBN: 978-91-7422-276-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: b7e91627-27d3-4ae5-91b6-250ada1f0341 (old id 1963064)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:09:12
• date last changed: 2018-11-21 21:02:58