Development of a Method to Measure Plasma Levels of Activated Protein C in Complex with Protein C Inhibitor

Abstract

Acute myocardial infarction (MI) and deep venous thrombosis (DVT) are conditions caused by thrombus formation with activation of the coagulation system. The plasma concentration of the complex between activated protein C (APC) and protein C inhibitor (PCI), APC–PCI complex is increased in such states. We have devised an immunofluorometric assay employing a catcher antibody (M36) that recognizes a neoepitope in APC–PCI complexes and cleaved PCI. The M36 Mab has a particularly strong binding affinity ( KD = 5 x 10-11M) for the complexed/cleaved PCI, which in combination with the neoepitoe specificity are the major differences compared to previous methods for APC–PCI measurements. The analytical detection limit of the method (0.06 µg/L, +3SD) is sufficient to allow accurate measurements of normal and low plasma concentrations of the APC–PCI complex. The mean in healthy individuals was 0.30 µg/L (0.17–0.54, ±2SD). In patients undergoing hip-arthroplasty, the APC–PCI level was maximal four hours postoperatively and returned to normal within 24 hours postoperatively. Two case-control studies were conducted. In the first, patients presenting at the Emergency Department with suspicion of DVT were included. Based on phlebography results, 123 patients were included. The APC–PCI levels were significantly higher in the 40 DVT patients than in the 83 controls, who had negative phlebography. Receiver operating characteristics (ROC) curves were calculated and demonstrated a discriminatory capacity most comparable to D-dimer, measured in the same patients. Compared to D-dimer, the APC–PCI complex is a more well-defined analyte. In the second study, plasma samples were collected from 74 patients admitted to the Coronary Care Unit for chest pain in combination with ECG changes. MI is preceded by activation of the coagulation system and thrombus formation initiated by a rupture in an atherosclerotic plaque. APC–PCI levels correlated closely with maximal CKMB levels, reflecting MI size, whereas there was no correlation between APC–PCI and CKMB or troponin I on arrival to hospital. Our studies indicate that the APC–PCI complex measured with the new method could be used to indicate patients at risk of developing venous thrombosis, and, the APC–PCI level is an early marker of activation of the coagulation system preceding MI.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Blodpropp i artärer och vener kan orsaka hjärtinfarkt, ge upphov till blodpropp i benens djupt liggande vener (djup ventrombos) och även i lungan (lungemboli). Detta är vanliga sjukdomar som är potentiellt livshotande i den akuta situationen eller kan leda till komplikationer på lång sikt. Behandling måste t ex vid hjärtinfarkt insättas snabbt för att ge så god effekt som möjligt. Diagnostiken av dessa tillstånd måste därför vara snabb för att man redan på akutintaget ska kunna välja rätt handläggning av patienten. För närvarande är framför allt hjärtinfarktdiagnostiken tidskrävande, men även diagnostiken av djup ventrombos eftersom den kräver röntgenundersökning. Det finns därför ett behov av nya laboratoriemetoder som är snabba, tillförlitliga och enkla att utföra. Skälet till att blodproppar bildas är att blodets levringsförmåga, eller tendens att koagulera, av någon anledning är ökad. Både ärftliga och förvärvade riskfaktorer bidrar till blodproppsbildning. Vid t ex djup ventrombos kan man genom blodprov mäta graden av koagulationsaktivering. Ett sådant mätvärde är koncentrationen av ett komplex mellan två proteiner i blodet, aktivt protein C (APC) och protein C hämmaren (PCI), APC-PCI komplex. De metoder som tidigare funnits för att mäta detta komplex har varit tidskrävande att utföra eller inte tillräckligt känsliga eller specifika för att detektera de låga nivåer som cirkulerar i blodbanan av komplexet. Denna avhandling är baserad på utveckling och klinisk utvärdering av en ny metod för att mäta APC-PCI komplexet.



Metoden är en immunfluorometrisk sandwich-metod, där två monoklonala antikroppar används, varav en är speciellt framtagen för att bara binda PCI i den form som är komplexbunden till APC. Den andra antikroppen binder APC. Det som skiljer denna metod från övriga, är att den antikropp som binder PCI i komplexet, binder med mycket hög affinitet, dvs. mycket starkt och är dessutom mycket specifik. Att det finns högre koncentration av icke-komplexbundet PCI i blodet stör således ej. Antikroppen känner enbart igen det komplexbundna. I det första arbetet har vi fastställt var antikroppen mot PCI binder PCI för att ge den så specifika egenskaper. PCI tillhör en grupp proteiner som kallas serin proteinas inhibitorer eller serpiner. Deras struktur ändras markant när de binder enzymet, serin proteinaset för att hämma det (i vårt fall APC). Vi har kommit fram till att antikroppen binder komplexbundet PCI i en del där det sker stora förändringar i samband med komplexbildningen. Bindningsstyrkan är hög, mätt i ett buffertsystem som dissociationskonstanten (KD).



Det andra arbetet beskriver metoden mer ingående och hur väl den fungerar i human blodplasma. Vi har bestämt metodens prestanda genom att dels mäta hur låga koncentrationer av APC-PCI komplex den kan detektera, dels med vilken precision den mäter samma prov vid upprepade tillfällen. Vi har också bestämt komplexnivån hos friska och redogör här för hur komplexnivån illustrerar den aktivering i koagulationssystemet som sker i samband med en höftledsoperation. I praktiken kan patienter som efter en större operation har förhöjda nivåer av APC-PCI komplex, vara i riskzonen för att drabbas av blodpropp.



I det tredje arbetet redovisar vi resultaten av en fall-kontroll studie för att utvärdera hur väl APC-PCI komplex metoden kan skilja patienter med djup ventrombos från friska. Andra metoder som mäter aktivering i koagulationssystemet har analyserats som jämförelse, såsom D-dimer som är en nedbrytningsprodukt av proteinet fibrin som bygger upp ett blodkoagel. Resultat utvärderade med ROC-analys visade att APC–PCI metoden var mest jämförbar med D-dimer. Den största skillnaden mellan de båda metoderna är att APC–PCI komplexet är en mer väldefinierad analyt. D-dimer metoder används vid olika laboratorium och dessa mäter delvis olika saker vilket gör att resultaten därför är svåra att jämföra. En annan begränsning är att endast ett negativt D-dimer resultat ger någon information till klinikern, nämligen att hos denna patient kan blodpropp uteslutas. Ett positivt resultat kan däremot orsakas av flera andra faktorer än blodpropp, t ex ett inflammatoriskt tillstånd. Ett användningsområde för vår APC-PCI metod kan vara att detektera en nyligen bildad blodpropp i de stora djupt liggande venerna i låret. Då dessa blodproppar har störst tendens att skicka iväg mindre proppar till lungorna och orsaka lungemboli, kan denna metod medföra nya diagnostiska möjligheter som kanske på sikt kan leda till tidigare insatt behandling av vissa patienter för att förhindra sjukdomsprogress. Upprepad analys av APC-PCI komplexet kan visa sig vara värdefullt som beslutsstöd vid behandling av trombossjukdom i de små venerna i vaden som inte progredierar, något som kräver utvärdering i större patientgrupper.



Det fjärde arbetet berör metodens användbarhet i en annan klinisk situation, nämligen bland patienter som kommer till akutmottagningen med misstänkt hjärtinfarkt. APC-PCI metoden jämfördes här med de proteiner som idag används som markörer i klinisk praxis för att diagnosticera hjärtinfarkt, CKMB och troponin I. Vi fann ett samband mellan nivån av APC–PCI i det prov som togs då patienten inkom till akutmottagningen, och den högsta CKMB nivå som uppmättes under vårdtiden, som också representerar infarktstorleken. I jämförelse med andra markörer för aktivering i koagulationssystemet, visade ROC-analysen en något bättre förmåga för APC-PCI komplex metoden att skilja patienter med hjärtinfarkt från dem med bröstsmärta av andra anledningar, medan skillnaden jämfört med CKMB- och troponin I-analys vid inkomsten inte var signifikant. Vi fann högre nivåer av APC-PCI komplex hos patienter som vid inkomsten hade ST-förhöjning på EKG. Detta representerar i sin tur en infarkt som förorsakar en skada i hjärtat som drabbar en större del av hjärtväggen. En liten grupp infarktpatienter kunde identifieras som hade förhöjda nivåer av APC-PCI komplexet vid inkomsten, medan nivåerna av CKMB var normala. Möjligen har dessa patienter behov av en snabbare insatt och mer intensiv behandling, något som behöver utvärderas i större patientgrupper. Nivåerna av APC-PCI komplex var anmärkningsvärt låga jämfört med dem vid djup ventrombos. Detta kan vara ett resultat av att den tid som APC-PCI komlexet finns i cirkulationen är relativt kort, eller att aktiveringen i koagulationssystemt är så lokaliserad i de små kranskärlen att det därför är svårare att detektera APC-PCI komplexet.

• author: Strandberg, Karin
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Bovill, EG, Dept. of Pathology, University of Vermont, USA
• organization: Clinical Chemistry, Malmö (research group)
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry
• keywords: protein C inhibitor, activated protein C, hypercoagulability, deep vein thrombosis, Clinical chemistry, myocardial infarction, Klinisk kemi
• pages: 142 pages
• defense location: Jubileumsaulan, MFC, University Hospital, Malmö
• defense date: 2001-10-04 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECM--1026--SE
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 274a5cf3-6d32-47a4-89d2-87f663ad45a4 (old id 20007)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:32:26
• date last changed: 2018-11-21 21:05:31