New aspects of voltage-gated calcium channel regulation in pancreatic beta-cells - Relevance for insulin release and type 2 diabetes

Abstract

Voltage-gated Ca2+ channels are essential transducers of cellular signals in many electrically excitable cells. In the pancreatic beta-cell they mediate controlled Ca2+ influx, which is the final trigger for Ca2+ dependent release (exocytosis) of the blood glucose lowering hormone insulin. Several subtypes of voltage-gated Ca2+ channels are known and the L-type has been found to be the main contributor to electrical Ca2+ currents in beta-cells. However, which L-type isoform is operative in human beta-cells and how the L-type channels may be regulated in health and disease are two questions that remain unanswered and formed the basis for this thesis.

The first study identified the redox protein glutaredoxin-1 to localize to rat beta-cell membranes and to be indispensable for glucose induced insulin release. In addition, its substrate NADPH reduces L-type channel activity while at the same time it is increasing the rate of insulin release. We suggest this to happen by a redox dependent mechanism that makes the exocytotic machinery more Ca2+ sensitive, thereby increasing its efficiency to release insulin.

In the second study we found that glucose stimulation of an insulin secreting cell line induces the internalization of the L-type channel isoform Cav1.2. This process is dependent on the eukaryotic translation initiation factor 3 subunit e (eIF3e). Impairment of this mechanism by suppressing the expression of eIF3e in human islets results in increased intracellular Ca2+ levels and augmented rates of apoptosis, two phenomena of great importance in the pathogenesis of beta-cell destruction in diabetes.

The third study revealed that the L-type Ca2+ channel isoform Cav1.3 is the major isoform in enriched human beta-cells and that islets of type 2 diabetes patients express reduced levels of Cav1.3 mRNA than controls. We also identified a single nucleotide polymorphism (SNP) that diminishes Cav1.3 expression and insulin release and 2 SNPs that increase the risk for type 2 diabetes. Investigating glucose dependent effects on Cav1.3 expression demonstrates that the beta-cell responds to increased glucose levels with a raise in Cav1.3 expression, which in turn is necessary for insulin release but also lifts the intracellular Ca2+ concentration to in the long run putatively cytotoxic levels.

In the last part of this thesis we gathered genetic, molecular and functional data about the two main L-type Ca2+ channel isoforms Cav1.2 and Cav1.3 in order to identify significant differences that may allow for development of currently unavailable isoform specific drugs. A review of the literature revealed that there are indeed discrete dissimilarities that could form the basis for such venture.

In conclusion this thesis not only supports the notion of L-type Ca2+ channels being essential for beta-cell function but also reveals new aspects that help to understand their regulation in health and disease with the prospect of this being of relevance for future scientific work.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in German

Spannungsgesteuerte Kalziumkanäle haben eine große Bedeutung in vielen elektrisch erregbaren Zellen, wie z.B. in Nervenzellen und pankreatischen beta-Zellen. Hier werden sie folgendermaßen aktiviert: In der Nahrung enthaltener Traubenzucker (Glukose) wird nach einer Mahlzeit über den Blutstrom im Körper verteilt und in die beta-Zellen über Glukosetransporter aufgenommen. Hier wird er metabolisiert und in chemische Energie in Form von ATP umgewandelt. Dieses ATP hemmt ATP-sensitive Kaliumkanäle, die normalerweise durch den Ausstrom positiver Kaliumionen ein negatives Zellmembranpotential bewirken. Durch ATP-abhängiges Schließen dieser Kanäle wird das Potential schnell positiv, was spannungsgesteuerte Kalziumkanäle veranlasst, sich zu öffnen. Der Kalziumeinstrom bewirkt das Verschmelzen von Insulinvesikeln mit der Zellmembran (Exozytose), welches die Ausschüttung des blutzuckersenkenden Hormons Insulin bewirkt. Insulin ist z.B. für die Glukoseaufnahme von Muskeln und Leber von großer Bedeutung. Ein zu niedriger Insulinspiegel führt daher zu verminderter Glukoseaufnahme von Muskeln und Leber und zu erhöhten Blutglukosewerten (Hyperglykämie), dem Hauptmerkmal von Typ 2 Diabetes.

Es sind mehrere Klassen und Subtypen von Kalziumkanälen bekannt. Es besteht Uneinigkeit darüber, welcher Subtyp entscheidend für die Funktion menschlicher beta-Zellen ist und es ist kaum bekannt, wie diese Kanäle in gesunden Zellen verglichen mit Zellen von Diabetes Patienten reguliert werden. Diese Fragen bildeten die Grundlage dieser Arbeit, aus der vier Studien hervorgegangen sind.

In Studie I konnten wir zeigen, dass das Protein Glutaredoxin-1 entscheidend für die glukoseabhängige Ausschüttung von Insulin ist. Dieser Mechanismus beruht auf der Verfügbarkeit von NADPH, welches ein Substrat für Glutaredoxin-1 ist, aber unabhängig davon auch Kalziumströme durch Kalziumkanäle reduziert. Wir nehmen an, das Glutaredoxin-1 durch NADPH die Effizienz der Insulinfreisetzung steigern kann. Dieser Mechanismus könnte von großer Bedeutung sein, da eine höhere Insulinfreisetzung, ohne dabei den Kalziumspiegel in den beta-Zellen zu erhöhen, ein attraktiver Weg wäre, stark beanspruchte Zellen zu schützen.

Studie II zielte auf die Ermittlung von Mechanismen ab, welche die Bewegung der Kalziumkanäle zur und von der Zellmembran kontrollieren. Es zeigte sich, dass Stimulation von beta-Zellen mit Glukose die Bewegung von Kanälen des Subtyps Cav1.2 von der Zellmembran in das Innere der Zelle (Internalisierung) bewirkt. Dieser Vorgang ist abhängig von der Präsenz des Proteins eIF3e und Unterdrückung dieses Proteins führt zum Fehlen der Kalziumkanalinternalisierung. Dies verursacht erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentrationen, welches die Zellen empfindlicher gegenüber anhaltender Glukosestimulation macht und deren Wachstum hemmt bzw. deren Absterben begünstigt. Diese Phänomene sind wichtige Merkmale bei der Entstehung von Diabetes und bedürfen daher weiterer Untersuchungen.

In der dritten Studie [III] untersuchten wir, welche Kalziumkanaluntergruppe in humanen beta-Zellen eine Rolle spielt und konnten Cav1.3 als hauptsächlich vorkommenden Subtyp bestimmen. Wir konnten darüber hinaus wichtige genetische Variationen, sog. Einzelnukleotid-Polymormphismen (engl. Single nucleotide polymorphisms, SNP) im Cav1.3 Gen CACNA1D identifizieren. Diese Variationen verringerten die Cav1.3 Bildung und bewirkten damit einen Rückgang der Insulinausschüttung sowie eine Erhöhung des Risikos für eine Typ 2 Diabetes Erkrankung. Des Weiteren lassen unsere Experimente darauf schließen, dass in beta-Zellen von gesunden Individuen länger anhaltende Glukosestimulation eine vermehrte Cav1.3 Bildung bewirkt, welches den intrazellulären Kalziumspiegel erhöht. Dies trägt auf lange Sicht möglicherweise zum in der späteren Phase der Diabetes Erkrankung bekannten Absterben der beta-Zellen bei.

Ziel der letzten Studie [IV] war es zu ermitteln, ob die in elektrisch erregbaren Zellen hauptsächlich vorkommenden Kalziumkanaltypen Cav1.2 und Cav1.3 in ihrer Struktur typspezifische Merkmale aufweisen, die als Ziele bislang nicht vorhandener spezifischer Hemmer oder Aktivatoren dienen könnten. Eine umfassende Literaturrecherche ergab, dass die beiden Kanäle mehrere voneinander unterscheidbare Strukturen und Bindungspartner besitzen, die möglicherweise als Angriffspunkte für spezifische Medikamente genutzt werden könnten.

In dieser Arbeit ist es gelungen, die wichtige Rolle von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen in pankreatischen beta-Zellen zu untermauern, und darüber hinaus neue Aspekte ihrer Regulation in gesunden beta-Zellen und in beta-Zellen von Typ 2 Diabetes Patienten darzustellen. Das gewonnene Wissen ist nicht nur relevant für das Verständnis der Funktion dieser Kanäle und ihrer Rolle bei der Entstehung von Typ 2 Diabetes, sondern bildet hoffentlich auch die Grundlage weiterführender Untersuchungen, die helfen die Krankheit besser zu verstehen und behandeln zu können.



Popular Abstract in Swedish

Spänningsberoende kalciumjonkanaler är viktiga för funktionen av många elektriskt aktiverbara celler, till exempel nervceller och pankreatiska beta-celler. I beta-celler aktiveras de på följande sätt: Näringsämnen till exempel druvsocker (eller glukos), vilka tas upp i tarmen, vidarebefordras genom blodflödet till beta-cellerna som tar upp glukos genom glukostransportörer. Genom metabolism av glukos skapas kemisk energi i form av ATP. ATP känsliga kaliumjonkanaler upprätthåller i vila en negativ membranpotential genom att transportera positiva kaliumjoner ut genom cellmembranet. När ATP nivån ökar, stängs de vilket medför att K+ joner hålls tillbaka, potentialen stiger till mer positiva värden och spänningsberoende kalciumjonkanaler aktiveras. Flöde av kalcium in i cellerna ger den avgörande signalen för frisättning av det blodglukos sänkande hormonet insulin genom en process som kallas exocytos. Otillräcklig insulinfrisättning kan framkalla för höga blodglukosvärdena (hyperglykemi), ett kännetecken för typ 2 diabetes.

Det finns flera klasser av spänningsberoende kalciumjonkanaler. En sådan klass är L-typ kanaler, som har en lång öppningstid och sannolikt är viktigast för kalcium-flöde in i beta-celler. Det finns olika underordnade L-typ kanaler (Cav1.1, 1.2, 1.3 och 1.4) och Cav1.3 har högst uttryck i många celler. Det är okänt vilken L-typ som spelar störst roll i humana beta-celler och hur L-typ-kanalerna regleras i beta-celler från friska människor jämfört med beta-celler från typ 2 diabetespatienter. Detta är grunden för min avhandling där de följande fyra studier ingår:

I den första studien (I) visar vi att redox-proteinet Glutaredoxin-1 finns i närheten av cellmembranet där det spelar en viktig roll för insulinfrisättningen. En nedreglering av uttrycket av Glutaredoxin-1 medför en minskad insulinsekretion. Ett viktigt substrat för Glutaredoxin-1 är den reducerande molekylen NADPH och dess närvaro är viktig för effekten på insulinfrisättningen. Därutöver har NADPH också en direkt effekt på L-typ-kalciumjonkanaler vilket har ett minskat kalciumflöde in i cellerna till följd. Det betyder att NADPH höjer insulinfrisättningen via Glutaredoxin-1 men samtidigt behövs mindre kalciummängder, vilket kan vara betydelsefullt för att skydda beta-cellen från förhöjda giftiga kalciumjonkoncentrationer.

Andra delarbetet (II) fokuserar på mekanismer som reglerar förflyttningen av kalciumjonkanaler till och från cellmembranen. Vi upptäckte att när beta-celler stimuleras med glukos, flyttas Cav1.2 från cellmembranen till cellens inre (cytoplasma). Detta är beroende av eIF3e, ett protein som sedan tidigare är känt som viktigt för förflyttningen av jonkanaler inom nervceller. Ett experiment, där vi sänkte uttrycket av eIF3e, visade att Cav1.2 inte kunde internaliseras längre. Detta medförde on ökad kalciumkoncentration i cellerna och en hämning av cellernas växt eller ett förhöjt antal av döda celler. Det sistnämnda är ett karakteristiskt kännetecken för den sista fasen av typ 2 diabetes där beta-celler i stor utsträckning dör och vi ska därför i framtiden undersöka eIF3e-s roll i denna process närmare.

Studie nummer 3 (III) identifierade Cav1.3 som den L-typ-kanalundergrupp med störst uttryck i humana beta-celler. I pankreatiska öar från patienter med typ 2 diabetes är uttrycket signifikant minskat. Vi hittade flera genetiska variationer (så kallade single nucleotide polymorphisms eller SNP) som är kopplade till nedsatt Cav1.3 uttryck, dämpad glukosstimulerad insulinfrisättning och även med ökad risk för typ 2 diabetes. Höga glukoskoncentrationer visade sig stimulera Cav1.3 uttryck i öar från kontrollindivider i närvaro av högt glukos under 24 timmar. Samtidigt ökade kalciumjonkoncentrationen inom cellerna vilket på lång sikt innebär en stor risk för en nedsatt funktion eller beta-cellernas död. Det kan därför vara intressant att undersöka om en hämning av kalciumjonkanaler medan man samtidigt ökar insulinfrisättningen genom kalciumoberoende mekanismer kan vara en väg för att skydda utsatta beta-celler t.ex. från risk patienter.

Sista studien (IV) riktade sig mot identifieringen av skillnader mellan Cav1.2 och Cav1.3 som kan hjälpa till att utveckla undergruppspecifika läkemedel vilka inte finns för närvarande. Det visade sig att det finns några sig skiljande strukturer mellan de två kanalerna såväl som unika bindningspartners, två faktorer som möjligtvis kan utnyttjas som mål för utveckling av specifika Cav1.2 eller Cav1.3-riktade läkemedel.

Sammanfattningsvis kan jag inte bara bekräfta att spänningsberoende L-typ kalciumjonkanaler är viktiga för beta-cellernas funktion och att Cav1.3 är den avgörande undergruppen i humana beta-celler. Jag beskrev också nya viktiga aspekter av deras reglering i friska beta-celler och i beta-celler från diabetespatienter. Detta kan vara en utgångspunkt och stöd för ytterligare studier som hjälper till att förstå den snabbt utbredande sjukdomen typ 2 diabetes.

• author: Reinbothe, Thomas
• supervisor: Erik Renström; Lena Eliasson; Leif Groop
• opponent: Prof. Drews, Gisela, University of Tübingen
• organization: Diabetes - Islet Patophysiology (research group); EXODIAB: Excellence of Diabetes Research in Sweden
• publishing date: 2011
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Clinical Medicine
• keywords: voltage-gated calcium channels, L-type, insulin secretion, type 2 diabetes
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2011:87
• pages: 154 pages
• defense location: Skåne University Hospital Malmö, Entrance 72, CRC aula
• defense date: 2011-09-30 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86871-36-9
• language: English
• LU publication?: yes
• id: f6f3ad73-b08e-4048-a6fe-b48fc976cb25 (old id 2154995)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:35:25
• date last changed: 2023-04-18 20:11:39