Bioprocess Monitoring and Control in Pseudomonas cepacia and recombinant Escherichia coli cultivations

Abstract

The control of cultivation conditions and its influence on growth and production have been investigated. The use of fed-batch processes have been demonstrated for several cultivation systems and so has the use of different control signals in these systems.



Fed-batch cultivation of Pseudomonas cepacia with on-line measurement and control of the growth rate limiting (toxic) substrate, sodium-salicylate, was investigated. The use of an external filter unit made it possible to determine the substrate level on-line, in the bioreactor. The measured signal was used in a control-loop for manipulating the feed-flow rate around a pre-determined feed profile.



Conventional analytical process equipment (dissolved oxygen sensor) have been used in a novel way to gain information on the metabolic status of Escherichia coli cells in glucose limited fed-batch cultivations. Models were constructed and compared to experimental results. It was possible to detect acetic acid formation from responses in dissolved oxygen signal upon transient pulses in glucose feed rate.



The influence of medium composition have been investigated in recombinant Escherichia coli protein production (xylanase deletion derivatives from Rhodothermus marinus). Using an exponential increase in feed-flow rate, resulting in a specific growth rate below µmax, the substrate level (glucose) could be kept at a low level in the bioreactor. The use of controlled cultivation conditions have made it possible to use lactose (an inexpensive alternative to IPTG) to induce the T7lac promoter for recombinant protein production.



The impact of recombinant protein production (protein L), using the temperature induced lambdaPR promotor, on growth rate and viability, was investigated and compared to the response of a non recombinant strain.



Monitoring of acetic acid using flow injection analysis was carried out. The stability of the immobilised enzymes, acetate kinase and pyruvate kinase, was very low when monitoring in cultivation systems. The presence of pyruvate in the medium interfered in the analytical system. That was solved by simultaneously measuring pyruvate and subtracting its contribution from the measured acetate signal.



An integrated analytical system for on-line measurements of intracellular compounds was developed. It allows measurement in cell debris containing samples by use of expanded beds for enzyme immobilisation in the analytical system.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Bioprocesser är samlingsnamnet på alla de system där man utnyttjar någon biologiskt aktiv komponent (biokatalysator) för att utföra (katalysera) en bestämd reaktion. I den här avhandlingen används ordet bioprocess för mikrobiologiska odlingsprocesser, och biokatalysatorn är då en mikroorganism. Man kan utnyttja mikroorganismer för att producera t.ex. enzymer (för miljövänlig pappersblekning, i tvättmedel), läkemedel (insulin, tillväxthormon), "sig själva" (bagerijäst) mm. Det finns olika typer av mikroorganismer som man kan använda och här har vi koncentrerat oss på bakterier. Vilken organism man väljer beror naturligtvis på vad man vill producera. De senare årens utveckling av genteknik har emellertid gjort att man väldigt ofta använder Escherichia coli. E. coli finns naturligt i tarmkanalen hos människor och djur, men de typer som man använder på ett laboratorium skiljer sig ganska mycket från den naturliga vildtypen. Med hjälp av gentekniska metoder kan man få E. coli att producera stora mängder av protein som egentligen hör hemma hos andra mikroorganismer (de två protein som studerats här) eller tom små enkla humana (mänskliga) protein (insulin, tillväxthormon). Dessa proteiner kallas rekombinanta proteiner. Det fungerar inte så bra att låta E. coli producera stora, komplicerade proteiner från högre organismer som djur och växter, bla. eftersom dessa ofta är glykosylerade (det finns sockergrupper kopplade på proteinet). Glykosyleringsmönstret är ofta viktigt för proteinets funktion och för sådana produkter får man välja någon annan typ av mikroorganism (t.ex. bagerijäst), insektsceller eller djurceller. Trots att en bakteriecell är så liten (en E. coli cell är ungefär en tusendels mm lång ) så sker det flera tusen olika reaktioner inne i cellen när den växer och förökar sig. När man odlar bakterier i syftet att producera rekombinanta proteiner ställer man till oreda bland dessa reaktioner eftersom man tvingar cellen att utnyttja dem på ett sätt som den egentligen inte skall göra. En viktig del i mikrobiell odlingsteknik är att försöka förstå och på något sätt mäta vad som händer inne i cellen. Innehållet i en bioreaktor består av metaboliskt aktiva (levande) celler i en vattenlösning med alla de näringsämnen som behövs för att bakterierna skall föröka sig och producera det man önskar. Dessutom blåser man luft in i vätskan för att bakterierna skall kunna respirera (andas) och rör om ordentligt för att skapa en homogen miljö. För att allting skall fungera bra måste innehållet i bioreaktorn hela tiden anpassas efter bakteriernas behov. Man måste se till att ha rätt temperatur, att det finns tillräckligt med näring och syre och att pH-värdet är rätt. Allt detta förändras efterhand som bakterierna förökar sig och därför måste man kompensera för dessa förändringar. Till det använder man kontroll och övervakningssystem som automatiskt ser till att t.ex. kyla när temperaturen stiger. Om man skall lyckas med sin odling och för att alltid uppnå samma resultat så är dessa styr- och övervakningssystem mycket viktiga.



Avsikten med det här arbetet har bla.varit att hitta nya mätmetoder för att bättre kunna förstå vad som händer under en odling. Dessa mätmetoder kan också användas för att styra processen, dvs att få bakterierna att göra det vi vill att de ska göra. Det finns ett välkänt problem då man odlar E. coli på glukos. Cellerna behöver glukosen för att kunna bygga ny cellmassa och för att få energi till detta. Om man doserar för mycket, klarar cellerna inte av att ta hand om glukosen på rätt sätt utan bildar ättiksyra istället. Ättiksyran påverkar cellerna negativt - de slutar växa och slutar att producera det rekombinanta proteinet. Det är därför viktigt att kunna mäta ättiksyrahalten i bioreaktorn. I detta arbete finns två metoder beskrivna som möjliggör detta. Det finns också beskrivet hur man doserar glukosen på rätt sätt, dvs att man hela tiden tillför precis lagom mycket. Att dosera rätt mängd näringsämne har varit även varit viktigt i ett arbete där vi har odlat en annan bakterie, Pseudomonas cepacia. Denna bakterie kan växa på en rad olika substanser, bla. på många giftiga föreningar. Fastän P. cepacia kan växa på tex, salicylsyra, så är det också giftigt för den. Då är det än viktigare att kontrollera tillförseln näringsämnet eftersom bakterierna dör vid överdosering.

• author: Tocaj, Anita
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Enfors, Sven-Olof, Department of Biochemistry and Biotechnology, KTH, Stockholm, Sweden
• organization: LTH School of Engineering in Helsingborg
• publishing date: 1997
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Industrial Biotechnology
• keywords: protein L, expanded bed, flow-injection analysis, recombinant protein production, acetic acid, on-line measurements, Pseudomonas cepacia, recombinant Escherichia coli, Fed-batch cultivations, control strategies, xylanase deletion derivatives from Rhodothermus marinus, Biotechnology, Bioteknik
• pages: 121 pages
• defense location: Center for Chemistry and Chemical Engineering, Sölvegatan 39, Lund, lecture hall A
• defense date: 1997-12-19 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUKDH/TKBT -- 97/1035 -- SE
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 8efe641c-e009-4baf-b6fb-4f344454d90b (old id 29791)
• date added to LUP: 2016-04-04 09:58:19
• date last changed: 2018-11-21 20:55:56