Targeting the hematopoietic stem cell to correct osteopetrosis

Abstract

This thesis focuses on developing stem cell targeted gene therapy for the severe hereditary disorder Infantile Malignant Osteopetrosis (IMO) as well as increasing the understanding of how the genetic defect present in IMO affects the hematopoietic stem cells and hematopoiesis in general.



IMO is a rare congenital disorder associated with an increased number of non-functional osteoclasts and the absence of bone resorption results in accumulation of sclerotic bone leading to abnormal bone marrow cavity formation insufficient to support hematopoiesis. The most common mutation is in the TCIRG1 gene seen in over 50% of the patients. The children suffer from bone marrow failure, anemia, thrombocytopenia, hepatosplenomegaly, immune dysfunction and recurrent infections. Furthermore, the impaired remodeling of the developing bone results in compression of cranial nerves which leads to neurological impairment, affecting especially vision and hearing which may progress to blindness and deafness. The only curative treatment available today for IMO is bone marrow transplantation. However, this can only be performed if the patient has a suitable stem cell donor. If untreated, the children die around the age of five. Currently no alternative treatment exists, thus IMO is a candidate disease for development of gene therapy.



The first two papers are based on studies conducted with the oc/oc mouse model that has a mutation in the homologous gene and shares the same osteopetrotic phenotype as seen in humans. Paper one focuses on developing a clinically relevant model for cell therapy in the oc/oc mouse by replacing radiation conditioning with low-dose busulfan conditioning prior to neonatal bone marrow transplantation and optimizing the administration procedure. In paper two, neonatal oc/oc mice were treated with bone marrow transplantation without any prior conditioning, which showed a rapid reversal of the severe osteopetrotic phenotype despite low level of engraftment and lack of selective expansion of the osteoclastic lineage. In manuscript three human stem cells from patients with IMO were studied and the paper provides the first proof-of-principle of lentiviral-mediated correction restoring the resorptive function of osteoclasts derived from peripheral blood CD34+ cells of IMO patients. In manuscript four the osteoclast significance in hematopoietic stem cell maintenance was studied by generating two adult osteopetrotic mouse models and subsequently analyzing the hematopoiesis of the mice. The results from this study indicate that osteoclast function is not essential for hematopoietic stem cell maintenance in adult mice.



Results obtained from the oc/oc mouse model and from IMO patient cells are encouraging for further development of hematopoietic stem cell targeted gene therapy, and will serve as basis for upcoming development of clinical gene therapy of osteopetrosis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Min avhandling har fokuserat på att öka förståelsen för den ovanliga, allvarliga genetiska sjukdomen infantil malign osteopetros (IMO), med målet att utveckla genterapi som en ny behandlingsform för sjukdomen. IMO finns redan vid födseln och orsakas av att osteoklasterna, cellerna ansvariga för nedbrytning av ben, inte fungerar. Sjukdomen kan orsakas av flera olika gendefekter men i över hälften av fallen är det en gen som kallas TCIRG1 som är muterad. Icke-fungerande osteoklaster leder till en kraftigt ökad bentäthet som påverkar blodkärl och nerver som komprimeras på grund av bristande hålutrymmen i skelettet. Trots bildandet av mer ben är benstrukturen skör och benbrott är vanliga. Kompression av bland annat syn- och hörselnerv leder till blindhet och dövhet. Slutligen upphör benmärgen att fungera och barn utan behandling dör vid ca fem års ålder, på grund av blodbrist och infektioner. Eftersom osteoklasterna har sitt ursprung i blodstamceller precis som övriga blodceller, kan sjukdomen botas genom benmärgstransplantation. På så sätt ersätts de defekta blodstamcellerna med stamceller från en frisk donator. Denna behandling är dock riskfylld och kräver att det finns passande donatorer tillgängliga.



I de första två arbetena har vi arbetat med en musmodell som också har en mutation i Tcirg1 genen och uppvisar liknande symptom som finns i människa. Dessa möss lever bara fyra veckor om de inte transplanteras med friska blodstamceller. Både i människa och mus måste oftast stamcellsmottagaren förbehandlas i syfte att skapa utrymme för transplanterade stamceller. I arbete ett optimerade vi transplantationsproceduren så att den blev mer kliniskt relevant för fortsatt forskning. Strålning byttes ut mot låga doser cellgift, och stamceller administrerades intravenöst, vilket resulterade i att biverkningar av strålningen eliminerades och administrationssättet effektiviserades. I arbete två transplanterade vi stamceller utan att först förbehandla mössen och upptäckte att även då kunde vi uppnå tillräckligt benmärgsanslag för att rädda mössen och få en komplett normalisering av benmärg och skelett. Detta är ett viktigt fynd som underbygger valet av IMO som en lämplig sjukdomskandidat för utveckling av genterapi.



Blodstamcellen har förmågan till självförnyelse och produktion av alla typer av celler i blodet under ett helt liv. Genom att korrigera dessa celler kan man återställa funktionen av alla osteoklaster som bildas. Grundidén med genterapi är att tillföra en normal genkopia till en cell som saknar eller har en defekt gen, så att patienten själv kan bilda ett funktionellt protein. Man har redan idag framgångsrikt behandlat vissa sällsynta sjukdomar som drabbar immunförsvaret med genterapi och har genom detta lyckats rädda patienter som annars inte skulle överlevt.

I arbete tre gick vi över till patientceller och använde oss av ett modifierat HIV virus som verktyg för att införa en normalt fungerande genkopia av TCIRG1 till blodbildande humana stamceller. Här visar vi att funktionen hos de defekta osteoklasterna korrigerades med ca 70-80% och nedbrytningen av ben visas genom att mäta nivåer av bland annat kalcium i blodet.



I arbete fyra var vi intresserade av att belysa osteoklasternas roll och betydelse för blodstamcellernas reglering i benmärgen hos vuxna möss. För att undersöka detta använde vi oss av två musmodeller: en med icke-fungerande osteoklaster och en som helt saknar osteoklaster. Blodstamceller från dessa musmodeller transplanterades sedan in i friska vuxna möss och efter flera månader analyserade vi blodet. Våra resultat visade ingen funktionell skillnad mellan blodstamcellerna från osteoklastdefekta musmodeller och friska blodstamceller, vilket kan bero på att osteoklasterna inte har så stor betydelse för stamcellsfunktionen i vuxna möss.



Sammanfattningsvis är dessa studier viktiga för en ökad förståelse av sjukdomen IMO och genterapi som behandlingform. Vi har även fått mer insikt i osteoklasternas roll i regleringen av blodstamceller. Med mål att bota barn med IMO inom den nära framtiden, väntar först ytterligare försök för att testa nya säkrare vektorer i optimerade musmodeller som är bättre anpassade för att analysera patientceller in vivo.

• author: Flores Bjurström, Carmen
• supervisor: Johan Richter; Stefan Karlsson
• opponent: Professor Carle, Georges F., Faculté de Médecine de l´Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice, France
• organization: Division of Molecular Medicine and Gene Therapy; StemTherapy: National Initiative on Stem Cells for Regenerative Therapy
• publishing date: 2012
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: Hematopoietic stem cells, bone marrow transplantation, gene therapy, osteoclasts, infantile malignant osteopetrosis
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2012:56
• pages: 63 pages
• defense location: Segerfalk lecture hall, BMC A10, Sölvegatan 17, Lund, Sweden
• defense date: 2012-09-06 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-87189-19-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: d56627b7-f730-4305-84b2-e37677ba0bf0 (old id 3052507)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:11:06
• date last changed: 2023-04-18 20:20:19