Molecular Mechanisms in Amyloid Disorders. Novel Treatment Options in Hereditary Cystatin C Amyloid Angiopathy.

Abstract

The pathophysiological process in Alzheimer’s disease and other amyloid disorders usually involves the transformation of a soluble monomeric protein via potentially toxic oligomers into amyloid fibrils. The structure and properties of the intermediary oligomers have been difficult to study due to their instability and dynamic equilibrium with smaller and larger species. This has hampered the development of a deeper understanding of the molecular pathophysiology of the disorders and strategies for their treatment. In hereditary cystatin C amyloid angiopathy (HCCAA), a cystatin C variant is deposited in arterial walls and causes brain hemorrhage in young adults. Although carriers of the cystatin C variant may be easily identified by genetic testing, no treatments are available.

In the present investigation, redox experiments involving a recombinant double-cysteine mutant of cystatin C were used to generate stable oligomers (dimers, trimers, tetramers, decamers and high-molecular-weight oligomers) and these were characterised concerning size, shape and function. The results showed the oligomers to be highly ordered, domain-swapped assemblies of cystatin C and that the oligomers could not build larger oligomers, or fibrils, without domain swapping. The stabilised oligomers were used to induce antibody formation in rabbits. Oligomer-specific antibodies were obtained and these could be used to selectively remove cystatin C dimers from biological fluids containing both dimers and monomers.

A miniaturised high-throughput system was developed and used to test 12 monoclonal antibodies and 1040 drugs in a clinical drug library for their capacity to reduce cystatin C dimer formation in vitro. Several candidates for treatment of HCCAA could be identified.

In a different set of patients, scheduled for elective surgery, the plasma levels of cystatin C, creatinine and four inflammatory markers were studied in order to investigate the influence of inflammation on cystatin C, to evaluate its usefulness as a marker of glomerular filtration rate (GFR, ‘kidney function’). The cystatin C level did not change significantly during the observation period (seven days) and did not correlate with the level of any of the four inflammatory markers, and thus, the inflammatory status of a patient does not influence the role of cystatin C as a marker of GFR.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Ett felaktigt protein som klumpar ihop sig i hjärnans blodkärl är orsaken till hjärnblödning och för tidig död hos unga islänningar. Sjukdomen är ärftlig och uppkommer på grund av en enda felaktig byggsten, orsakad av en mutation, i proteinet cystatin C. Det muterade proteinet bildar mikroskopiska proteinkedjor, fibriller, som klumpar ihop sig i bland annat hjärnans blodkärl. Detta leder så småningom till att blodkärlet spricker och det uppstår en hjärnblödning.

Med genteknik har den felaktiga genen hos islänningarna tidigare kopierats. En syntetisk version av genen har förts in i bakterier, som kan tillverka det muterade proteinet i laboratorieflaskor. Genom att i flera steg rena fram det isländska proteinet från bakterierna, är det möjligt att studera hur proteinet beter sig i lösningar som liknar kroppens egna. Dessa undersökningar har visat att proteinet bildar par genom att två proteinmolekyler hakar i varandra, så kallat domänutbyte. Samma domänutbytesmekanism, där flera molekyler hakar i varandra, ligger bakom bildandet av de långa proteinkedjorna, fibrillerna. Detta innebär att en substans som blockerar domänutbytet, skulle kunna användas i ett läkemedel för att förhindra fibrillbildning hos patienterna.

I ett av projekten som beskrivs i föreliggande avhandling, var målet att hitta substanser som verkar stabiliserande och förhindrar domänutbyte hos det muterade proteinet. Ett experimentellt system, där proteinet efter upprening försiktigt värmdes upp för att få proteinet att byta domäner och bilda par, provades noggrant ut. Proteiner är normalt sett känsliga för värme och det var en stor utmaning att hitta precis rätt förhållande för att driva på domänutbyte, utan att förstöra proteinet. Det finns ett obegränsat antal kemiska substanser som skulle kunna fungera, och det skulle ta oändligt lång tid att testa substanser en i taget. Därför var ett viktigt delmål att utforma ett testsystem där ett stort antal substanser kan testas samtidigt. Men det var mödosamt och tidskrävande att rena fram de mängder av proteinet som behövdes, och därför utvecklades ett snabbtest i miniatyrformat. För att testa om en substans, i det nya systemet, kunde blockera parbildning hos det muterade proteinet, krävdes endast två mikrogram cystatin C i en tiomikroliters portion. Detta gjorde det möjligt att gå igenom 1040 kända läkemedel för att se om de har någon stabiliserande effekt. Ett antal olika antikroppar testades också, och sammantaget hittades ett flertal kandidater som verkade stabiliserande. Dessa utvärderas nu ytterligare i andra experimentella system, för att de bästa substanserna skall kunna väljas ut.

Ett flertal andra obotliga sjukdomar, till exempel Alzheimers sjukdom och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom; det vill säga den mänskliga formen av galna ko-sjukan, orsakas av att proteiner, andra än cystatin C, bildar fibrillklumpar. Vid dessa sjukdomar, samt även vid isländsk hjärnblödning, har man i elektronmikroskop sett speciella ringformer, som uppträder före fibrillerna bildas. Dessa ringformer har visats vara mycket giftigare för celler än fibriller. Mellanformerna har dock varit svåra att undersöka, beroende på att de är flyktiga och inte låter sig isoleras. Med bristande kunskaper om de molekylära mekanismer som orsakar denna grupp av sjukdomar har inga verksamma läkemedel kunnat utvecklas. Eftersom domänutbytesmekanismen har konstaterats också vid Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, finns skäl att misstänka att samma eller snarlika mekanismer ligger bakom flera sjukdomar i denna grupp.

I en av studierna användes en designad genvariant av cystatin C som, i precis rätt kemisk miljö, kunde förmås att bilda stabila mellanformer. Det miniatyriserade testsystemet var här mycket användbart, eftersom ett stort antal kemiska förhållanden behövde prövas ut, innan de stabila mellanformerna kunde erhållas. Efter en framgångsrik uppreningsprocedur kunde mellanformerna undersökas gällande storlek, form och funktion. Alla mellanformer, vilka bestod av två, tre, fyra och tio länkade molekyler samt en ännu större form, visade sig ha bildats genom domänutbyte. Ingen av dem kunde bygga större former, eller fibriller, utan domänutbyte, och mellanformen som bestod av tio molekyler hade en tydlig ringform när den undersöktes i elektronmikroskop. De stabiliserade mellanformerna användes för att bilda antikroppar i kaniner. De antikroppar som erhölls var specifika för mellanformer och kunde, efter en särskild uppreningsprocedur, användas för att selektivt ta bort mellanformer av cystatin C i ett blodbaserat testsystem.

I ett tredje projekt studerades en egenskap hos cystatin C som är av betydelse för alla kategorier patienter, d.v.s. om halten av cystatin C i blod kan påvisa njursjukdom. I en grupp patienter, som skulle genomgå kirurgi, undersöktes om inflammation hos patienter påverkar halten av cystatin C i blodet, eller om halten till största delen beror på hur väl njurarna fungerar. Detta gjordes som ett led i att utvärdera om halten av cystatin C är ett användbart mått på njurfunktionen. Halten av cystatin C förändrades inte nämnvärt under observationsperioden och samvarierade inte med halten av någon av de fyra inflammationsmarkörerna som uppmättes. Alltså påverkar inte det inflammatoriska tillståndet hos en patient hur väl cystatin C fungerar som markör för njurfunktion.

• author: Östner, Gustav
• supervisor: Anders Grubb; Magnus Abrahamson
• opponent: Professor Theodorsson, Elvar, Clinical Chemistry, Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, Sweden
• organization: Division of Clinical Chemistry and Pharmacology
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Pharmacology and Toxicology; Medicinal Chemistry
• keywords: cystatin C, amyloid, amyloidosis, oligomers, domain swapping
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2013:78
• pages: 98 pages
• defense location: Wallenberg Neurocenter, Segerfalksalen, BMC, Sölvegatan 17, Lund, Sweden
• defense date: 2013-09-14 09:15:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-87449-50-5
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ac5adbc0-ad17-45fb-94cd-2a840a9cea56 (old id 4017160)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:23:18
• date last changed: 2019-05-21 21:31:46