Vacuolar Ca2+-ATPases in Plants. Regulation by calmodulin binding to a N-terminal autoinhibitory domain.

Abstract

The calcium ion (Ca2+) is essential for all plant and animal life. One important function of Ca2+ is as a second messenger in the responses of the cell to environmental and hormonal signals as well as in some intrinsic developmental processes. The intracellular concentration of Ca2+ must be strictly regulated, since a high concentration of free cytosolic Ca2+ is toxic. All eukaryotic cells carry calcium-transporting enzymes, Ca2+-ATPases, that pump Ca2+ out from the cytosol, across the plasma membrane or into the endo(sarco)plasmic reticulum and the vacuole. The Ca2+-ATPases have a high affinity for Ca2+ and keep the cytosolic free Ca2+ concentration at 100 — 200 nM. In mammalians, seven Ca2+-ATPase genes have been identified, while in the model plant Arabidopsis thaliana eleven Ca2+-ATPases have been identified. Ca2+-ATPases can be divided into two major groups: those that bind and are stimulated by calmodulin (CaM) and those that are not.



The cDNA, BCA1 (Brassica oleracea Ca2+-ATPase 1), for a vacuolar, CaM-stimulated Ca2+ -ATPase from cauliflower was cloned by PCR, based on sequence information from tryptic peptides obtained from the CaM-affinity-purified protein. The location to the vacuolar membrane was confirmed by confocal immunomicroscopy on sections from cauliflower inflorescence. The CaM-binding domain was identified within the first 43 amino acids in the N terminus, which is in contrast to the animal plasma membrane Ca2+-ATPases which have their CaM-binding domain in the C terminus. The N terminus of BCA1 was expressed as a fusion protein and shown to bind CaM in a Ca2+-dependent fashion. Results from inhibition studies with a peptide corresponding to the CaM-binding domain of BCA1, indicate that the N terminus also functions as an autoinhibitor. The autoinhibitory domain overlaps at least partially with the CaM-binding domain. In vitro phosphorylation studies and controlled proteolysis suggest that the BCA1 N terminus probably also is a target for phosphorylation and regulatory proteolysis.



Taken together, the results demonstrate the regulatory importance of the N terminus of BCA1 as a target for CaM binding, trypsin cleavage, and possibly phosphorylation, as well as its importance as an autoinhibitory domain. BCA1 was the first plant Ca2+-ATPase cloned for which a Ca2+-pumping activity had been shown for the corresponding gene product, and also the first Ca2+-ATPase shown to have a CaM-binding domain at its N terminus. The N-terminal location of the CaM-binding regulatory domain has later turned out to be a typical feature of CaM-stimulated Ca2+-ATPases in plants.



The cloning and characterization of a vacuolar CaM-stimulated Ca2+-ATPase from Arabidopsis, ACA4 (Arabidopsis Ca2+-ATPase 4) is also described. ACA4 is 84% identical to BCA1, contains an N-terminal CaM-binding domain, and was shown to localize to small vacuoles in Arabidopsis protoplasts. Overexpression of activated ACA4 protected Arabidopsis seedlings against elevated NaCl in the growth medium, indicating a role for ACA4 in response to salt stress and one possible physiological function of a Ca2+-ATPase in planta.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Kalcium är ett livsviktigt ämne för både djur och växter. Kalcium behövs t.ex. för uppbyggnaden av skelettet, för att hjärtat skall slå och för att musklerna skall dras samman. I växter är kalcium en viktig beståndsdel i cellväggarna och behövs också vid bl.a. celldelning. Trots detta måste koncentrationen av fria kalciumjoner inne i cellen (i cellvätskan) hållas mycket låg, eftersom för hög koncentration av fritt kalcium är skadlig för cellen. Detta beror till stor del på att kalciumjonerna då reagerar med den fosfat som finns i cellen och som är livsnödvändig för cellens ämnesomsättning. Den bildade kalciumfosfaten är olöslig och kan därför inte användas av cellen. Tack vare sin låga koncentration kan kalciumjonerna användas som budbärare vid överföring av en mängd olika signaler i cellen. Vid signalöverföringen höjs kalciumkoncentrationen tillfälligt, men den måste sedan sänkas till normalnivå.



För att reglera kalciumkoncentration inne i cellen har ett antal proteiner utvecklats vars funktion är att transportera bort kalciumjonerna från cellvätskan. Kalciumjonerna kan antingen transporteras ut från cellen eller in i s.k. organeller som finns inne i cellen. Största delen av växtcellen fylls upp av en organell som kallas vakuol och som är en viktig upplagringsplats för kalcium i växtceller. Liksom andra organeller omsluts vakuolen av en tunn hinna (membran) i vilken sitter olika proteiner, bland annat kalciumpumpar (kalcium-ATPaser). Koncentrationen av kalcium utanför cellen eller inne i organellerna är 1000 — 10000 gånger högre än i cellvätskan. Transporten av kalcium från cellvätskan sker således mot en stor koncentrationsgradient och är energikrävande. Energin tas från spjälkning av den energirika föreningen ATP och kopplas till transporten av kalcium genom membranet, därav namnet kalcium-ATPas. ATP är en som används av cellen i många olika sammanhang. Figur 2, sid. 19, visar en cell med de kalciumtransporterande proteiner man känner till i dag.



Jag har arbetat med kloning och karakterisering av ett kalcium-ATPas i blomkål kallat BCA1 (för Brassica oleracea Ca2+-ATPase 1). Det var sedan förut känt att kalciumtransporten hos detta protein stimulerades av ett annat mindre och lösligt kalciumbindande protein, calmodulin. BCA1 kunde också renframställas genom selektiv inbindning till calmodulin. Det renade proteinet kunde klyvas med ett proteas (ett enzym som klipper upp aminosyra-kedjan på vissa bestämda ställen) och aminosyra-sekvensen kunde bestämmas för en del peptider. Detta förfaringssätt låg till grund för kloningen av hela genen (artikel I): d.v.s. att rena den del av blomkåls-DNAt som kodar för BCA1 och att göra många kopior av BCA1-sekvensen. När man väl känner till DNA-sekvensen kan man översätta den till motsvarande aminosyrasekvens. BCA1 består av 1025 aminosyror av vilka de flesta vetter mot cellvätskan, d.v.s. den del av cellen där kalciumkoncentrationen måste hållas låg (se figur 6, sid. 41). Sekvensanalys antydde att det fanns en calmodulinbindande del alldeles i början (i den s.k. N-terminalen) av BCA1, vilket var något nytt. Liknande enzymer i djurceller har nämligen sin calmodulinbindande del alldeles i slutet av proteinet. Detta tydde på att kalcium-ATPaser i växter fungerar på ett lite annorlunda sätt än de gör i djur.



Vi har fortsatt arbetet med karakterisering av BCA1 (artikel II). Både biokemiska studier och undersökning i mikroskop visar att BCA1 finns i vakuolmembranet. Vi kunde visa att N-terminalen binder calmodulin på ett kalciumberoende sätt. Bortklyvning av N-terminalen aktiverar också enzymet och resulterar i att den calmodulinbindande delen då försvinner. Detta tyder på att N-terminalen även har en hämmande funktion. En peptid motsvarande den calmodulinbindande delen hämmade kalcium-transporten. Vi har vidare studerat reglering där en fosfatgrupp binder in till vissa aminosyror på proteinet, s.k. fosforylering, vilken är en mycket vanlig regleringsmekanism för många enzymer.



Sammantaget visar resultaten att N-terminalen har en viktig, reglerande funktion hos BCA1. Detta stöds av andra forskargrupper, då det har visat sig att alla hittills kända calmodulinstimulerade kalcium-ATPaser i växter har en lång N-terminal innehållande den calmodulinbindande sekvensen. Det är för närvarande inte känt hur denna skillnad mot djur har uppkommit eller om det har någon fysiologisk betydelse.



Jag har dessutom arbetat tillsammans med en grupp i Köpenhamn. Där studerades ett kalcium-ATPas i en annan växt, Arabidopsis thaliana (backtrav; artikel III). Detta kalcium-ATPas, ACA4, kunde klonas genom att man letade i databasen efter sekvenser vilka liknade BCA1. Jag gjorde här främst växtfysiologiska försök på genmodifierad Arabidopsis som hade tillförts en extra DNA-sekvens kodande för en aktiv form av ACA4. Jag undersökte då dessa växters förmåga att växa i närvaro av höga halter NaCl (koksalt) och jämförde med omodifierade växter. Det visade sig att de växter som hade mer av aktivt ACA4 kunde växa bättre i närvaro av förhöjd saltkoncentration än de som inte hade detta aktiva ACA4. Det kan tyda på att ACA4 är viktigt i växtens försvarsmekanism mot saltstress.



Arabidopsis kallas ibland "växtforskarnas bananfluga" och används mycket på grund av sitt lilla genom (totala DNA-innehåll), sin snabba tillväxt och korta livscykel. I likhet med det mer kända HUGO-projektet för kartläggning av det mänskliga genomet, finns det ett internationellt projekt för att kartlägga och sekvensera hela Arabidopsis-genomet. Det projektet är snart färdigt, och hittills har man identifierat 11 olika kalcium-ATPas gener att jämföras med sju kända kalcium-ATPas gener i människa. Man vet inte varför växter har så många olika kalcium-ATPaser, och att ta reda på detta blir en spännande uppgift för framtida studier!

• author: Malmström, Susanna
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Williams, Lorraine, University of Southampton, UK
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2000
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Plant biochemistry, N terminus, autoinhibitory domain, vacuole, calmodulin, calcium, plants, Ca2+-ATPase, Växtbiokemi
• pages: 137 pages
• defense location: Dept. of Plant Biochemistry, Sölvegatan 35, Lund
• defense date: 2000-09-06 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUNKDL/NK VK-00/1017
• ISBN: 91-973252-6-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: db0e10d0-6bd2-468c-818c-8831c0939729 (old id 40602)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:41:28
• date last changed: 2018-11-21 21:06:31