Studies of bacterial surface proteins interacting with the immune system

Abstract

Pathogenic bacteria express a wide array of surface proteins that interact with the environment. Many of these proteins are believed to be important for the virulence. This thesis deals with the binding of immunoglobulins (Ig) and complement regulating proteins to certain bacterial surface proteins. Protein L from Peptostreptococcus magnus binds to Igk-light chains while protein A from Staphylococcus aureus binds both IgGFc and the variable domain of the Ig heavy chain. To generate a protein capable to bind a wide array of Ig fragments lacking the Fc region we constructed a chimeric protein consisting of the Ig-binding domains from protein L and A. This protein, designated protein LA, retained all the functions of the separate parts and could be used for purification of Ig and Ig fragments. The Ig-binding domain of protein L consists of an a-helix packed on a four stranded b-sheet. To determine which amino acid residues of the Ig-binding domain that are important for binding, 76 variants with single site-specific mutations were generated. When the binding kinetics of these variants were analysed only a small number of the mutants displayed binding kinetics that were different to the original Ig-binding domain. The residues that upon mutation caused a significant change in affinity all clustered in two distinct patches on opposite sides of the protein L module suggesting that a single Ig-binding domain can bind two k-light chains. M proteins are expressed on the surface of group A streptococci (GAS), an important human pathogen, and have for a long time been recognised as important virulence factors. Some M proteins have earlier been shown to interact with factor H (FH) that regulates the activation of the complement system. Here we demonstrate that M proteins also can bind the factor H-like protein-1 (FHL-1), another complement regulatory protein. The interaction was shown to involve the seventh short consensus repeat found in both FH and FHL-1 and two different regions of the M protein were found to be responsible for these interactions. GAS variants that express M proteins deleted for the regions involved in binding of FH and FHL-1 were analysed and it was shown that binding of FH and FHL-1 was not crucial for survival of GAS in blood.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

En av de viktigaste substanserna i vår kropp är proteiner, också kallade äggviteämnen. Proteiner har en mängd olika uppgifter i kroppen, de finns i våra celler där de har olika uppgifter såsom att fungera som enzymer, transportörer, signalsubstanser, eller som skyddsfaktorer. Proteiner ingår också som viktiga beståndsdelar i vävnaderna mellan cellerna och finns dessutom också i vårt blod, i saliv och i tårar, där de bland många andra funktioner bl.a. deltar i försvaret mot mikroorganismer. Givetvis fyller proteinerna en lika viktig funktion hos alla levande organismer, inklusive bakterier och virus. Proteiner är långa kedjor sammansatta av mindre komponenter som kallas aminosyror. Det finns 20 aminosyror som har olika egenskaper och beroende på hur dessa aminosyror kombineras bildas olika proteiner. För att proteiner ska fungera veckas de långa kedjorna till mer kompakta tredimensionella strukturer. Denna avhandling handlar om hur proteiner på ytan av bakterier interagerar med proteiner som produceras av kroppen och som är en del av vårt försvar mot infektioner, det så kallade immunsystemet. Kroppen har flera olika sätt att skydda sig mot infektioner: Dessa kan grovt delas in i ett medfött försvar och ett förvärvat försvar. En viktig del av det medfödda försvaret är det så kallade komplementsystemet som består av en mängd olika proteiner i blod och andra kroppsvätskor. Vid en infektion aktiveras komplementsystemet på ytan av bakterierna. Aktiveringen av komplement sker som en kaskad och om den inte regleras så aktiveras mer och mer komplement hela tiden. Beroende av vilken typ av bakterie det är kan komplementsystemet döda bakterierna direkt eller så kan komplementsystemet markera bakterierna så att dessa äts upp av så kallade ätarceller eller fagocyter. För att inte komplementsystemet ska aktiveras på ett felaktigt sätt och leda till skador på kroppen så finns det också proteiner i blodet som har till uppgift att nedreglera komplementsystemet. Utöver det medfödda försvaret så utvecklas varje gång vi kommer i kontakt med en ny typ av bakterier ett försvar som är specifikt för denna typ av bakterier. Detta försvar gör att vi sällan kan infekteras med samma bakterietyp mer än en gång i livet. En av det förvärvade försvarets viktigaste beståndsdelar är antikroppar. Antikroppar är proteiner som kan binda specifikt till ett ämne. När antikroppar binder till bakterier markerar de dessa så att de kan bli uppätna av fagocyter. Antikroppar som bundits till bakterier kan också aktivera komplementsystemet vilket i sin tur kan hjälpa till att döda bakterier.



Många olika typer av bakterier har proteiner på sin yta som gör att de kan binda upp antikroppar oavsett deras specificitet. Man tror att denna bindning förhindrar funktionen hos antikropparna (dvs. möjligheten att märka ut bakterier för fagocyter eller komplement). Några av dessa proteiner har isolerats från bakterier och kan användas för att rena antikroppar. Protein L och protein A är två sådana proteiner. Protein L och protein A binder till olika delar av antikroppar och olika mycket av olika typer av antikroppar. Båda proteinerna binder också antikroppar från djur men också här skiljer de sig åt när det gäller från vilka djur de kan binda antikroppar. För att få ett protein som binder så många olika typer av antikroppar som möjligt har vi gjort ett protein som består av delar från både protein L och protein A. Detta protein, protein LA, binder både de antikroppar som binds av protein L och de antikroppar som binds av protein A. När styrkan av bindningen till olika antikroppar undersöktes band protein LA lika starkt eller starkare än protein L eller protein A ensamma till alla antikroppar som testades. Protein LA kunde också användas för att rena antikroppar från både blodplasma och saliv.



Protein L innehåller fem domäner som binder antikroppar. I varje domän finns en del som består av 62 aminosyror som binder till antikroppar. Dessa 62 aminosyror har en speciell tredimensionell struktur som består av fyra så kallade b-strängar och en a-helix. För att undersöka vilka aminosyror i en antikropps bindande protein L domän som är viktiga för interaktionen med antikroppar har vi gjort 76 olika varianter av den antikroppsbindande domänen där en aminosyra har bytts ut mot en annan. Interaktionen mellan dessa 76 varianter och antikroppar undersöktes och det visade sig att bara ett litet antal varianter hade en ändrad bindningsstyrka jämfört med den oförändrade antikropps bindande domänen. De aminosyror som föreföll viktiga för bindningen fanns i två olika områden av den tredimensionella strukturen av den antikropps bindande domänen vilket indikerar att var och en av de fem antikroppsbindande domänerna i protein L kan binda två antikroppar.



Grupp A streptokocker är en av de vanligaste sjukdomsframkallande bakterierna hos människa. De ger upphov till en rad olika vanliga sjukdomar, till exempel halsfluss, svinkoppor och scharlakansfeber men de kan också ge allvarligare infektioner som kan vara livshotande. För att streptokockerna ska kunna överleva och växa när de kommer i kontakt med kroppens försvarsmekanismer producerar de en mängd olika så kallade virulensfaktorer. Bland annat har streptokockerna proteiner på ytan som binder olika proteiner i blod. Streptokockerna utsöndrar också proteiner som klyver olika proteiner i kroppen. Ett av proteinerna som finns på ytan av streptokocker, kallat M protein binder till ett av de proteiner som reglerar komplementsystemet. Detta protein, faktor H, skulle när det binds till streptokocker kunna göra så att inte komplementsystemet aktiveras på ytan av streptokocker. I en första studie undersökte vi vilken del av faktor H som binder till M proteinet. Faktor H består av 20 domäner som är mycket lika varandra och vi fann att M protein kan binda till domän nummer 7. Vi fann också att M protein kan binda en variant av faktor H som kallas faktor H-likt protein-1 och som bara innehåller sju domäner av de 20 domäner som finns i faktor H. De delar av M proteinet som är viktiga för att binda till faktor H och faktor H-likt protein-1 identifierades genom att vi jämförde bindningsegenskaperna hos varianter av M proteinet där olika delar hade tagits bort. Vi fann att två olika delar av M proteinet band till faktor H och faktor H-likt protein-1 men att det ena området var av större betydelse. Streptokocker som uttryckte olika varianter av M protein däribland varianter som inte band faktor H och faktor H-likt protein-1 undersöktes för att studera om bindningen av faktor H och faktor H-likt protein-1 är viktigt för streptokockers möjlighet att överleva i blod. Vi fann att bindningen av faktor H och faktor H-likt protein-1 inte påverkar streptokockers möjlighet att överleva i blod men det är möjligt att bindningen av dessa faktorer är viktiga när streptokockerna befinner sig i andra delar av kroppen.

• author: Svensson, Henrik G
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Nygren, Per-Åke, The Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden
• organization: Division of Microbiology, Immunology and Glycobiology - MIG
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Microbiology in the medical area; Immunology in the medical area
• keywords: bakteriologi, Mikrobiologi, virologi, mykologi, Microbiology, bacteriology, virology, mycology
• pages: 117 pages
• defense location: Rune Grubb-Salen, BMC, Lund
• defense date: 2002-11-07 13:15:00
• ISBN: 91-628-5416-X
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Svensson, H. G., Hoogenboom, H. R. and Sjöbring, U. (1998) Protein LA, a novel hybrid protein with unique single-chain Fv antibody- and Fab-binding properties. Eur. J. Biochem. 258:890-896 Article: II. Svensson, H. G., Wedemeyer, W. J., Kortemme, T., Kim, D. E., Sjöbring, U. and Baker, D. Contributions of amino-acid side chains to the kinetics and thermodynamics of the bivalent binding of Protein L to Ig k light chains. Submitted. Article: III. Kotarsky, H., Hellwage, J., Johnsson, E., Skerka, C., Svensson, H. G., Lindahl, G., Sjöbring, U. and Zipfel, P. F. (1998) Identification of a Domain in Human Factor H-like Protein-1 Required for the Interaction with Streptococcal M Proteins. J. Immunol. 160:3349-3354 Article: IV. Kotarsky, H., Gustafsson, M., Svensson, H. G., Zipfel, P. F., Truedsson, L. and Sjöbring U. (2001) Group A streptococcal phagocytosis resistance is independent of complement factor H and factor H-like protein 1 binding. Mol. Microbiol. 41(4):817-26
• id: 4c8fa1bf-7501-4a67-8db2-bf16b37a521c (old id 465040)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:09:12
• date last changed: 2018-11-21 21:09:17