Violaxanthin De-epoxidase and the Xanthophyll Cycle

Abstract

The xanthophyll cycle is a mechanism for short term adaptation of plants to varying light intensities. It involves a reversible conversion of violaxanthin to zeaxanthin, via the intermediate antheraxanthin, upon high light intensities. This conversion is catalyzed by violaxanthin de-epoxidase (VDE) and the product after de-epoxidation, zeaxanthin, is involved in non-photochemical quenching of excess light energy absorbed by the plant. VDE is a 43 kDa protein, soluble in the thylakoid lumen at high pH. At low lumenal pH, VDE undergoes a conformational change, promoting the active enzyme to bind to the thylakoid membrane. There, zeaxanthin is formed from violaxanthin and excess energy can be dissipated as harmless heat energy, through non-photochemical quenching.



Besides violaxanthin, VDE also requires ascorbic acid as a substrate. Ascorbic acid is oxidized when violaxanthin is reduced. The presence of a lipid that can form an inverted hexagonal phase is required for binding of VDE to occur. Regulatory divalent cations were found to inhibit VDE activity.



VDE has three distinct regions; a cystein-rich N terminus and a charged C terminus, that both form mainly a-helical secondary structures, and a lipochalin region in between with multiple b-strands in a barrel structure. Four histidine residues, within the lipocalin region, are highly concerved. Chemical modifications and point mutations of the histidines showed that they are important for enzymatic activity. The 3D structure for VDE is not known, but the conformational change of the enzyme has been seen as a difference in accessibility of disulfide bridges for reduction at pH 5 and 7. Binding studies of VDE to the thylakoid membrane showed that the conserved histidine residues are involved in the conformational change. Protonation of the histidine sidegroup around pH 6 leads to binding of the enzyme to the thylakoid membrane, within a narrow range and with a cooperativity around 4, with respect to protons, for spinach VDE with 4 histidines. Wheat VDE, with 3 histidine residues has a cooperativity around 3. Mutant forms of VDE, with less than four histidine residues, showed a lower cooperativity for membrane binding than the wildtype.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Allt liv kräver energi. Energin kan komma från olika källor, såsom nedrytning av organiska eller oorganiska föreningar, värme eller ljus. Fysikens lagar säger oss att energi inte kan nyskapas eller förbrukas, bara omvandlas mellan olika former. På så sätt tillgodogör vi oss energin i mat när vi omvandlar kemiskt bunden energi till värme, då den förbränns i kroppens muskelceller, eller till uppbyggnad av andra molekyler för kroppens reparation och tillväxt. På samma sätt kan växter tillgodogöra sig ljusenergi från solen, genom att omvandla denna till kemiskt bunden energi för uppbyggnad av växten. Denna process kallas för fotosyntes. Växter har utvecklat ett komplext system för att maximera ljusupptagningsförmågan och för att effektivt kunna använda sig av denna energi med så små energiförluster som möjligt. I växtens celler sker fotosyntesen i organeller kallade kloroplaster, vilka bl.a. innehåller pigmentet klorofyll, som ger växten dess gröna färg (Fig. 1). I kloroplastens inre membran, thylakoidmembranet, finns det fotosyntetiska maskineriet; ett antal proteinkomplex, som upptar solenergi och omvandlar denna till de energirika molekylerna ATP och NADPH. Denna första del av fotosyntesen kallas ljusreaktionen (Fig. 2A).



Den andra delen av fotosyntesen, mörkerreaktionen, kräver som namnet antyder inget ljus. Här används de energirika molekyler, som bildats i ljusreaktionen, till att bygga upp större molekyler, som växten behöver för tillväxt och lagring av energi, såsom socker, stärkelse, proteiner och fett. Denna reaktion sker också i kloroplasten, men är inte knuten till thylakoidmembranet, utan sker ute i stroma.



Även om det är viktigt för växten att kunna maximera sin ljusupptagningsförmåga när tillgången på ljus är begränsad, är det ibland lika viktigt att kunna begränsa densamma. Om för mycket energi tas upp i det fotosyntetiska maskineriet kan detta leda till överexcitering, vilket kan förstöra proteinkomplexen i thylakoidmembranet, vilket i sin tur kan leda till att växten dör. För att undvika att detta sker har växter även utvecklat en rad olika mekanismer för att skydda sig vid för starkt ljus. Eftersom växter inte kan förflytta sig är dessa skyddsmekanismer absolut nödvändiga för överlevnad. Exempel på sätt att skydda sig mot starkt ljus är att orientera bladen så att solens strålar inte träffar bladens hela yta eller att förflytta kloroplasterna så att de befinner sig vinkelrätt mot bladets yta och skuggar varandra. En annan skyddsmekanism är xanthophyllcykeln, som finns i samtliga högre växter, alger och vissa bakterier. Genom denna kan växter omvandla överflödig, och potentiellt skadlig, ljusenergi till ofarlig värmeenergi, som kan lämna växten genom värmestrålning.



Xanthophyllcykeln omfattar tre pigment, violaxanthin, antheraxanthin och zeaxanthin, som omvandlas, i ett cykliskt förlopp, av de två enzymerna violaxanthin de-epoxidas (VDE) och zeaxanthin epoxidas (ZE). VDE är ett vattenlösligt enzym och finns fritt i lumen vid högt pH (ðpH 7). Då kloroplasten belyses, byggs en protongradient upp över thylakoidmembranet och pH sjunker i thylakoidens lumen (Fig. 2A). Runt pH 6 genomgår VDE en konformationsförändring och enzymet binder till thylakoidmembranet, där det omvandlar violaxanthin till zeaxanthin via intermediatet antheraxanthin. Vid lågt ljus, d.v.s. högt pH i lumen, är VDE återigen lösligt i lumen och ZE återbildar violaxanthin till zeaxanthin, återigen via antheraxanthin (Fig. 4). ZE finns på stroma-sidan av thylakoidmembranet och har ett pH-optimum runt pH 7.



I mitt arbete har jag studerat VDE och regleringen av detta enzym. Det har inte varit känt vad som sker vid komformationsförändringen och inbindningen av VDE till thylakoidmembranet. Att en konformationsförändring sker har man däremot tidigare visat med hjälp av de disulfidbryggor, som finns i det veckade proteinet. DTT är ett reduktionsmedel, som reducerar disulfidbryggor, och som har visat sig inaktivera VDE vid lågt pH (pH 5). Vid högt pH (pH 7) är disulfidbryggorna inte åtkomliga för reduktion, vilket innebär att det har skett en konformationsförändring i enzymet mellan dessa pH-värden. Jag har studerat fyra konserverade histidiner, som finns i VDE från spenat och fyra andra växtarter (romaine sallad, tobak, Arabidopsis och Camellia), av de totalt sju arter, från vilka VDEs aminosyrasekvens är känd. I de två övriga arterna, två gräsväxter (vete och ris), är tre av histidinerna konserverade, medan den fjärde är ersatt av en arginin. En jämförelse mellan spenat- och vete-VDE visade att det pH-intervall under vilket enzymet binder in till membranet är mindre för spenat-VDE än för vete-VDE, vilket pekar på att antalet histidiner i proteinet påverkar kooperativiteten (pH-beroendet) för inbindningen. Det samma gällde i mutanta former av spenat-VDE, där en eller två histidiner hade blivit utbytta mot alanin eller arginin. Ett mindre antal histidiner gav lägre kooperativitet för inbindningen. Då alla fyra histidinerna i spenat-VDE byttes ut resulterade detta i ett inaktivt enzym. Aktiviteten kunde också inhiberas genom kemisk modifiering av histidinerna, vilket ytterligare stöder att dessa aminosyror är involverade i den konformationsförändring och inbindning till thylakoidmembranet, som sker då pH i lumen sjunker. Jag har också studerat hur magnesium- och calcium-joner påverkar VDEs aktivitet och presenterar resultat som visar att dessa divalenta katjoner inhiberar VDE-aktivitet redan vid mycket låga halter. Den långa inaktiveringstiden skulle kunna reflektera en jämvikt mellan de två konformationerna av enzymet.

• author: Gisselsson, Anna
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Jahns, Peter, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Plant biochemistry, zeaxanthin., xanthophyll cycle, violaxanthin de-epoxidse, thylakoid, regulation, quenching, protonation, pH-dependence, light stress, histidine, Conformational change, domains, Växtbiokemi
• pages: 108 pages
• defense location: Hall D, Center of chemistry and chemical engineering
• defense date: 2003-05-14 10:30:00
• ISBN: 91-973969-5-8
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Marie Eskling, Anna Emanuelsson and Hans-Erik Åkerlund (2001)Enzymes and mechanisms for violaxanthin-zeaxanthin conversion. In: Advances in photosynthesis and respiration, Regulation of Photosynthesis pp 433-452 (B Andersson and E-M Aro, eds) Kluwer Academic Publishers. ISBN 0-7923-6332-9* Article: II. Anna Emanuelsson, Marie Eskling and Hans-Erik Åkerlund (2003)Chemical and mutational modification of histidines in violaxanthin de-epoxidase from Spinacia oleracea. Physiologia Plantarum. In press. Article: III. Anna Emanuelsson, Anna Szilagyi and Hans-Erik Åkerlund (2003)Binding of violaxanthin de-epoxidase to the thylakoid membrane – cooperativity of native enzyme and mutants. Submitted for publication. Article: IV. Anna Emanuelsson and Hans-Erik ÅkerlundDivalent cation influence on violaxanthin de-epoxidase activity. Manuscript.
• id: 6f84f75a-f70c-4685-8cdb-2d4f7ce191c9 (old id 465723)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:29:24
• date last changed: 2018-11-21 20:59:03