The regulation of factor Va activity by activated protein C -Importance of the individual activated protein C cleavage sites in factor Va

Abstract

The subject of this thesis is the activated protein C (APC)-mediated inactivation of factor Va. The activated form of factor V (FVa) is a procoagulant cofactor for Factor Xa (FXa) in the conversion of prothrombin to thrombin. The procoagulant function of FVa is down regulated by APC through proteolytic cleavage at three sites, Arg306, Arg506 and Arg679. The cleavage at Arg506 is kinetically favored, while the cleavage at Arg306 is needed for full loss of procoagulant activity. The cleavage at Arg679 is believed to play a minor role for the loss of FVa activity. Numerous plasma components have been reported to influence the inactivation of FVa. Factor V variants were constructed recombinantly to evaluate the importance of each of the three APC cleavage sites in the FVa inactivation and how they are influenced by numerous plasma components.



The stimulation of FVa inactivation by protein S, originally believed to only involve the Arg306 cleavage, was in this thesis shown to affect all three cleavage sites. The inhibition by FXa was confirmed to selectively involve the Arg506 cleavage and protein S was shown to counteract the inhibition, due to competitive binding of protein S and FXa to FVa. The prothrombin inhibition was shown to involve all three cleavage sites.



Three natural occurring mutations in the FV gene were expressed and characterized. In FV Hong Kong and FV Cambridge the amino acid at the 306 site is substituted. Unlike the more common mutation that affects the Arg506 site (FV Leiden), these mutations were shown not to cause a serious APC-resistance phenotype and the FVa inactivation was not seriously impaired. In addition to its procoagulant function, intact FV has an anticoagulant function, as it works as a cofactor for APC in the degradation of Factor VIIIa. The APC cofactor activity is severely impaired in FV Leiden, but our studies show that in FV Hong Kong and FV Cambridge this activity is only partly hampered. FV Liverpool is a mutation found in two brothers with thrombotic tendency. The mutation causes the position of an additional carbohydrate in FV. We showed that the FVa inactivation and FV cofactor function were impaired due to impaired binding of APC and protein S to FVa.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Blodcirkulationen fungerar i kroppen som ett transport system för proteiner, syre och andra metaboliter. Blodet har den svåra uppgiften att vara flytande och samtidigt kunna koagulera på ställen där kärlet går sönder. Störning i denna balans leder till sjukdomar som hjärtinfarkt och blodpropp eller motsatsen svåra blödningar.



Det protein som jag har studerat ingår vid koagulation (levring) av blodet. Faktor V (romersk siffra) upptäcktes av en norrman, Paul Owren. Paul Owren undersökte blodet från en patient med svåra blödningar. Han fann att patienten saknade en komponent i blodet som behövdes för att kunna koagulera. Då detta var den femte komponenten som behövdes, gav han den namnet faktor V och sjukdomen som kvinnan hade kallades parahemofili. Sedan dess har många fler proteiner identifierats som är viktiga för blodkoagulationen. Nu vet vi att koagulationen består av ett antal enzymer, proenzymer och proteiner som i samspel slutligen leder till en slutprodukt som går från flytande till fast form. Enzymer är proteiner som påskyndar reaktioner. Proenzymer är proteiner som om de aktiveras omvandlas till enzymer. Denna omvandling sker genom att enzymer klyver proenzymerna på specifika ställen. På detta vis är koagulationen arrangerad som ett vattenfall där ett enzym aktiverar nästa, vilket i sin tur aktiverar ytterligare ett enzym. Det finurliga med detta arrangemang är att man i varje steg får en förstärkning av signalen då varje enzym aktiverar mer än ett proenzym. De flesta reaktionerna sker på ytan av celler. Där samlas proteinerna till komplex. Ett sådant komplex kan bestå av ett enzym, ett proenzym som ska klyvas, och ett protein som hjälper enzymet i processen, en kofaktor. Faktor V är en kofaktor till enzymet faktor X som aktiverar protrombin till trombin. Trombin är ett mycket viktigt enzym med många funktioner, det aktiverar flera enzymer och kofaktorer, som till exempel faktor V. Trombin binder också till receptorer på cellytan vilket gör att cellerna binder koagulationsproteiner bättre. Slutligen klyver trombin fibrinogen till fibrin vilket medför att ett nätverk av fibrin bildas där blodplättar kan fastna och en plugg bildas som hindrar ytterligare blödning.



Efter att blödningen har avstannat är det viktigt att reglera processen så att blodet inte koagulerar på opassande ställen. Av denna anledning finns det enzymer och proteiner som motverkar koagulationen, de ingår i det som kallas antikoagulationen. Protein C är ett protein som reglerar koagulationen genom att inaktivera två kofaktorer, faktor V och faktor VIII. Inaktiveringen går till så att aktiverat protein C (APC) klyver faktor V och faktor VIII på specifika ställen som gör att delar av proteinet dissocieras, det vill säga faller sönder. APC klyver faktor V på tre ställen, vid aminosyra nummer 306, 506 och 679. Det är dessa tre klyvningar som jag har studerat. Förutom detta har faktor V ytterligare en funktion. Den fungerar som kofaktor till APC vid nedregleringen av faktor VIII. Med andra ord har faktor V såväl prokoagulanta som antikoagulanta egenskaper.



Precis som brist på prokoagulanta faktorer kan ge risk för blödning kan brist på antikoagulanta proteiner ge risk för blodpropp. Således medför brist på protein C ökad risk för blodpropp. Genom att ta ett blodprov och mäta hur lång tid det tar för blodet att koagulera i närvaro respektive frånvaro av APC kan man undersöka hur effektivt protein C är på att motreglera koagulationen. På detta sätt upptäcktes en ny ärftlig defekt av Björn Dahlbäck. Han såg att koaguleringen av vissa blodprov inte blev förlängd lika mycket i närvaro av APC, och han kallade detta för APC-resistens. Senare blev det visat att APC-resistens är orsakat av en mutation som gör att aminosyran vid position 506 i faktor V byts ut mot en annan aminosyra. APC kan inte längre klyva faktor V vid 506 och nedreglering av koagulationen går därför långsamt. Samtidigt hittade Björn Dahlbäck att faktor V fungerade som kofaktor vid nedregleringen av faktor VIII, och det blev visat att faktor V behövde klyvas vid 506 av APC för att den skall kunna fungera som antikoagulant kofaktor. Med andra ord, när faktor V är muterad vid 506 blir den svårare att inaktivera och samtidigt kan den inte fungera som en antikoagulant kofaktor. APC-resistens är den vanligaste kända ärftliga defekten som orsaker venös blodpropp.



Klyvningen av faktor V med hjälp av APC sker vid olika hastigheter och leder till olika förlust av aktivitet vid de tre klyvningsställena. Vid 506 är den snabb men leder bara till partiell förlust av prokoagulant aktivitet. För att faktor V helt ska förlora sin prokoagulanta förmåga, måste APC också klyva vid 306, men den reaktionen är långsammare. 1998 upptäcktes två ärftliga defekter som leder till utbyte av aminosyran vid 306 vilket medför att APC inte längre kan klyva där. De två klyvningarna hittades av forskare i Hong Kong och i Cambridge och döptes därför till FV Hong Kong och FV Cambridge. FV Hong Kong visade sig vara vanlig bland kineser i Hong Kong och ser inte ut att leda till ökad risk för blodpropp. FV Cambridge tycks däremot vara mycket ovanligare, vilket gör det svårt att avgöra om den ger ökad risk för blodpropp eller inte. I arbete I studerade jag dessa två mutationer för att försöka förstå varför de inte tycks ge ökad risk för blodpropp medan mutationen vid 506 gör det. Med hjälp av molekylärbiologiska metoder uttryckte jag dessa och andra varianter av faktor V. Proteinerna undersöktes i APC-resistenstest, inaktivering av dem testades och deras förmåga att fungera som antikoagulant kofaktor blev också prövad. I APC-resistenstestet gav de två varianterna tider som låg mellan det normal FV gav och det faktor V-varianten som var muterat vid 506 gjorde. Inaktiveringen av de två mutanterna var nästan fullständig. Det innebär att även om klyvningen vid 306 behövs för full förlust av aktivitet, ger kombinerad klyvning vid 506 och 679 nästan fullständig förlust av aktivitet. Då dessa varianter av faktor V också kan fungera nästan lika bra som normal faktor V som antikoagulant kofaktor, verkar det förklara varför de inte ger ökad risk för blodpropp.



I de tre följande studierna undersökte jag hur olika komponenter i blodet påverkade de olika APC klyvningsställena i faktor V. Protein S är en kofaktor till APC vid nedregleringen av både faktor V och faktor VIII. I faktor V har man trott att protein S endast påskyndar klyvningen av 306. I delarbete II visar jag att klyvningen vid 506 också påskyndas av protein S, och en av konklusionerna från delarbete I var att även 679 klyvningen påskyndas av protein S. I delarbete II blev även olika egenskaper vid cellytan undersökta. Faktor X är det prokoagulanta enzym som faktor V fungerar som kofaktor för, och protrombin är proenzymet som klyvs av faktor X. I delarbetet III studerade jag hur faktor V när det är bundet till faktor X inte blir nedreglerat lika effektivt av APC. Det var redan känt att det klyvningställe som hämmas av faktor X är 506, medan det fanns olika uppfattningar om faktor X även kan hämma 506 klyvningen när protein S också är närvarande. Mina studier tyder på att om protein S är närvarande kan inte faktor X på samma sätt skydda faktor V mot inaktivering. Vilket av klyvningsställena protrombin skyddar var inte tidigare känt och i delarbete IV visar jag att protrombin skyddar både 306 klyvningen och 506 klyvningen. De här studierna gav bättre insikt i hur nedregleringen av faktor V sker i blodet och hur eventuella förvärvade eller ärftliga tillstånd kan samspela med de kända mutationerna i faktor V som riskfaktorer för blodpropp.



I det sista delarbetet studerades en ärftlig defekt hos en patient i Liverpool. Patienten är en pojke som har haft svåra blodproppar vid flera tillfällen. DNA-analys av hans faktor V-gen visade att den ena genen inte uttrycktes, och att den andra innehöll en mutation som gör att en extra sockermolekyl binds till faktor V. Vi uttryckte faktor V-varianten med den extra sockermolekylen och studerade hur denna blev inaktiverad av APC, och hur den fungerade som antikoagulant protein. Våra analyser visade att både inaktiveringen av faktor V och dess förmåga att fungera som en APC kofaktor vid nedregleringen av faktor VIII var hämmad. De upptäckterna förklarar sannolikt varför patienten har haft blodproppar. Troligen är sockermolekylen i vägen för APC och protein S vid inbindningen till faktor V. Studien är ett exempel på hur man kan gå från en klinisk observation till att finna en ändring på gennivå och sedan demonstrera hur detta orsakar en förändrad funktion.

• author: Norström, Eva
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Tans, Guido
• organization: Clinical Chemistry, Malmö (research group)
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry
• keywords: extracellulära vätskor, Hematologi, extracellular fluids, Haematology, activated protein C resistance, activated protein C, Blood coagulation, Factor V
• pages: 186 pages
• defense location: Aulan vid medicinkliniken, MAS, ingång 35, plan 1
• defense date: 2003-05-08 10:15:00
• ISBN: 91-628-5637-5
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Norstrøm, E., Thorelli, E. and Dahlbäck, B. Functional characterization of recombinant FV Hong Kong and FV Cambridge. Blood 2002; 100:524-530 Article: II. Norstrøm, E., Steen, M. and Dahlbäck, B. Importance of protein S and phospholipid for activated protein C.mediated cleavages in factor Va. Submitted Article: III. Norstrøm, E., Steen, M. and Dahlbäck, B. Effects of factor Xa and protein S on the individual APC-mediated cleavages of factor Va. manuscript Article: IV. Norstrøm, E., Tran, S. and Dahlbäck, B. Prothrombin inhibition of the individual activated protein C cleavage sites in factor Va. manuscript Article: V. Steen, M.‡, Norstrøm, E.‡, Bolton-Magg PHB, Mumford, A., McVey, JH., Tuddenham, EGD and Dahlbäck, B. Functional characterization of factor V Liverpool: Ile359Thr. A novel mutation associated with thrombosis. manuscript‡These authors contributed equally to this work
• id: 34e07ece-8c46-4ea4-ad96-89199b5c3d3f (old id 466235)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:30:52
• date last changed: 2018-11-21 20:59:11