Intestinal ischemia and reperfusion. Proinflammatory response and organ dysfunction

Abstract

Intestinal I/R is considered to be an important initiating event in several pathophysiological conditions such as trauma, bleeding, sepsis and pancreatitis, frequently leading to concomitant both single and potentially multiple organ dysfunction. The purpose of this thesis was to study mechanims underlying the development of multiple organ dysfunction, with special focus on intercellular proinflammatory regulation in the concurrent development of tissue injury. A further aim was to evaluate novel forms of therapy and prevention against the development of multipel organ dysfunction. Experimental intestinal I/R was induced by clamping the superior mesenteric artery in male Sprague-Dawley rats for 40 min, followed by reperfusion up to 12 hrs. Treatment attempts with N-Acetylcystein (NAC), the platelet activating factor (PAF) inhibitor lexipafant, monoclonal antibodies (MAbs) against platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1), active-site-inactivated FVIIa (FVIIai) or the FXa inhibitor fondaparinux were tested. It was found that intestinal I/R induced an increase in intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression in different tissues with marked organ variability. In parallel, an inflammatory response with neutrophil recruitment in the lungs and intestines as well as an increased endothelial barrier permeability in several organs was observed. Inflammatory mediators such as TNF-a, IL-1b, MCP-1 and MIP-2 also increased, with an earlier response in organs directly affected by the I/R-injury than in organs more distantly located. Treatment 15 min after the start of reperfusion with NAC and lexipafant attenuated the inflammatory response, but did not affect the ICAM-1 expression, suggesting that the protective effects of NAC and PAF-inhibition is not mediated via decreased expression of ICAM-1. Therapy inserted at 3 hrs of reperfusion, also decreased the inflammatory response and tissue injury, although not as pronounced as demonstrated after early treatment. Administration of the anticoagulants FVIIai or fondaparinux resulted in decreased plasma levels of the neutrophil chemoattractant MIP-2, whereas only FVIIai restored endothelial barrier dysfunction and decreased intestinal neutrophil recruitment. This demonstrates that inhibition of the TF-FVIIai complex formation by FVIIai can attenuate inflammatory responses in connection with intestinal I/R. Based on our results, we suggest that a multimodal treatment regime with inhibitors against inflammatory mediators such as oxygen free radicals, platelet activating factor and coagulation factors such as FVIIa and FXa, could represent potential future strategies in the prevention and treatment of organ dysfunction in hyperinflammatory states, seen e.g. in association with critical illness.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I detta avhandlingsarbete studerades mekanismer underliggande utveckling av multipel organdysfunktion (MODS), med fokusering på intercellulär proinflammatorisk reglering och adhesionmolekylers roll vid den fortsatta utvecklingen av organskada samt att studera eventuella organspecifika skillnader. Målsättningen var att finna nya behandlingar och prevention mot utveckling av multipel organsvikt. MODS är fortfarande den ledande dödsorsaken på kirurgisk intensivvårdsavdelning och mortalitetsfrekvensen korrelerar bl a till antalet sviktande organ. Nedsatt funktion av tarmbarriären, inducerad av intestinal ischemi och reperfusion kan uppstå i en rad olika kliniska situationer såsom vid trauma, hemorragisk chock, sepsis, hjärtinfarkt, svåra brännskador, intestinal obstruktion eller mesenterialkärlstromboser och kan i ogynnsamma fall bidra till uppkomsten av multipel organsvikt. Med målet att specifikt studera akutfas-svar och organsvikt, användes i detta avhandlingsarbte en icke-infektiös modell för MODS: intestinal ischemi och reperfusion (I/R) på råtta, vilket utförs genom avstängning av a. mesenterica superior under 40 min, åtföljt av reperfusion under varierande tider upp till 12 tim.



ARBETE I. ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) är en s k ECAM (endothelial cell adhesion molecule) från immunoglobulinfamiljen, som medierar den fasta bindningen av leukocyter till kärlendotelet och migrationen ut i vävnaden. ICAM-1 uttrycks på olika cellmembran, bl a fibroblaster, epitel- och endotelceller i de flesta vaskulariserade vävnader. Genom en teknik med radioisotopmärkning av dubbla monoklonala antikroppar kunde vi påvisa en uppreglering av antalet ICAM-1 molekyler efter intestinal ischemi och reperfusion och att det förelåg stora skillnader i uttryck mellan olika organ. Kärlrika organ med stor endotelyta, som lunga och lever, förefaller ha ett större uttryck av ICAM-1. Vidare kunde vi visa att en rubbning i ett flertal organs (lever, lunga, bukspottkörtel, mjälte) endotelbarriär uppstår liksom ökad aktivitet av enzymet myeloperoxidas i lungan som tecken på ökad mängd vita blodkroppar, efter intestinal ischemi och reperfusion. Samtidigt sågs en ökad nivå av den proinflammatoriska cytokinen IL-1b samt en minskad nivå av albumin och proteasinhibitorer i plasma. De minskade nivåerna av albumin och protesinhibitorer beror sannolikt på en kombination av konsumtion, minskad produktion och läckage över endotelet.



ARBETE II. Flera inflammatoriska mediatorer deltar i den inflammatoriska processen. Tumor necrosis factor (TNF)-a är en s k cytokin som anses vara en av de centrala och tidigt i förloppet förekommande proinflammatoriska mediatorerna. Monocyte chemoattractant protein (MCP)-1 är en s k chemokin som attraherar och aktiverar f a monocytära leukocyter, men har också visats kunna utöva liknande effekter på neutrofila leukocyter. Detta arbete syftade till att kartlägga produktionen och frisättningen av dessa två inflammatoriska mediatorer vid intestinal I/R och utröna om ett samband till anhopningen av leukocyter i lunga och tarm förelåg. Vi kunde konstatera att både TNF-a och MCP-1 ökade efter intestinal I/R, såväl lokalt i lunga och tarm som i plasma. Sköljvätska från lunga och bukhåla visade lägre nivåer men med samma tidsmässiga mönster. Samtidigt noterades en ökning av myeloperoxidas i lunga och tarm som tecken på en vävnadsanhopning av leukocyter. Ökning av myeloperoxidas sågs tidigare i tarmen, dvs nära den direkta skadan, än i lungan. Även om sambandet inte är klarlagt tyder resultaten på att TNF-a och MCP-1 medierar rekryteringen av leukocyter till olika vävnader vid intestinal I/R-skada.



ARBETE III. I detta arbete kunde vi visa att behandling med en antioxidant som N-Acetylcystein (NAC) eller en hämmare av platelet activating factor (PAF) givet 15 min efter reperfusionsstart, minskade permeabilitetsrubbningen över endotelet i lunga och tarm. Även anhopningen av leukocyter i lungan och plasmanivåerna av den proinflammatoriska cytokinen IL-1b minskade efter behandling med NAC eller PAF-hämmare. Däremot påverkades inte utrycket av ICAM-1 vilket tyder på att den observerade minskningen av permeabilitetsstörningen måste ske via andra mekanismer än denna adhesionsmolekyl. Även anhopningen av leukocyter i lungan förefaller inte vara helt beroende av ICAM-1, vilket delvis stöds av andra studier, där bindningen mellan liganden CD18 och ICAM-1 inte har visat sig vara nödvändig för leukocytadhesion i lungan. En tänkbar mekanism kan vara en ökad stelhet i leukocyternas cytoplasma vilket leder till minskad deformbarhet och att leukocyterna fastnar i lungkapillärena. Denna förändring av cytoplasmans egenskaper skulle kunna utlösas av fria syreradikaler och PAF vilket då delvis kan förklara varför NAC och PAF-hämmare minskar leukocytanhopningen i lungan.



ARBETE IV. I detta arbete användes en modell för att samtidigt studera såväl endotel- (kapillär) som epitelbarriärpermeabilitet (tarmbarriär) in vivo över isolerad tarmslynga. I denna modell mäts läckaget av albumin märkt med olika isotoper antingen infunderat i tarmlumen eller injicerat i blod. Vid intestinal ischemi/reperfusionsskada noterades en ökad permeabilitet i båda riktningarna och samtidigt en systemisk konsumtion av plasmainhibitorer. Tidigare studier i gruppen har visat att behandling före I/R-skadan eller tidigt i förloppet med N-Acetylcystein (en s k scavenger för fria syreradikaler) och PAFI (platelet-activating factor inhibitor) förbättrade tarmbarriärfunktionen, minskade cytokinnivåerna och konsumtionen av proteasinhibitorer samt minskade anhopningen av leukocyter i lungan och tunntarmen. I den kliniska situationen är dock förbehandling eller tidig behandling ofta inte praktiskt möjlig då patienten kommer under vård i ett senare skede. Det var därför av intresse att studera effekter på det inflammatoriska svaret och organskada vid senare insatt terapi. Vi kunde här visa att även senare (efter 3 tim reperfusion) insatt behandling (inkl antikroppar mot ahesionsmolekylen PECAM-1) hade en viss, dock inte lika uttalad, effekt på motsvarande parametrar. Permeabilitetsrubbningen över både epitelet och endotelet minskade dock utan att albuminnivåerna i plasma ökade nämnvärt. Sannolikt beror de minskade albuminnivåerna mer på minskad produktion och ökad konsumtion än på läckage över endotelet. Plasmanivåerna av de undersökta proteashämmarna sjönk drastiskt efter intestinal I/R, men endast antitrombin III restaurerades delvis efter behandling. Även de efter I/R förhöjda plasmanivåerna av IL-1b sjönk efter behandling. Intestinal I/R ökade myelo-peroxidasaktiviteten i tarmen, tydande på en ökad vävnadsanhopning av leukocyter. Såväl NAC, PAF-hämmare som monoklonala antikroppar mot adhesionsmolekylen PECAM-1 minskade MPO-aktiviteten drastiskt. Generellt hade alla tre behandlingsstrategierna en hämmande effekt på det inflammatoriska svaret och organskada. Kombinationsbehandling visade sig inte vara effektivare än singelterapi.



ARBETE V. På senare år har det blivit alltmer uppenbart att det inflammatoriska svaret samspelar med blodkoagulationen bl a genom att en ökad koagulation kan inducera ett ökat inflammatoriskt svar. Vävnadsfaktorn eller tissue factor (TF) är den fysiologiska initieraren av koagulationen och uttrycks normalt bara på extravaskulära celler, men kan även uttryckas på cirkulerande celler vid inflammatoriska tillstånd. Vid aktivering bildar TF ett komplex med koagulationsfaktor VIIa, vilket startar koagulationskaskaden, som efter ett flertal steg slutar med bildning av fibrin och ett stabilt blodkoagel. Genom blockering av specifika steg i koagulationskaskaden finns förhoppningen att kunna påverka och minska det inflammatoriska svaret. I detta arbete använde vi två olika antikoagulantia som gavs 90 min före ischemistart. Dessa var active-site-inactivated factor VIIa (FVIIai), vilket är koagulationsfaktor VIIa som är blockerat i sitt aktiva bindningsställe och fondaparinux, en selektiv hämmare av faktor Xa. Vi kunde visa att FVIIai minskade den I/R-utlösta permeabilitetsrubbningen över endotelet i tarmen. Även i lungan noterades ett minskat, dock inte signifikant, albuminläckage. Myeloperoxidasaktiviteten i tarmen och plasmanivån av chemokinen MIP-2 minskade efter behandling med FVIIai. Fondaparinux hade endast effekt på plasmanivåerna av MIP-2, vilka minskade. Detta är vad vi vet den första studien som visar att antikoagulationsbehandling kan ha en inflammationsdämpande och organprotektiv effekt vid intestinal I/R-skada och ger förhoppning om nya behandlingsformer vid olika akuta inflammatoriska tillstånd.



De patofysiologiska mekanismerna vid MODS förefaller ofta tämligen likartade, trots varierande underliggande genes. Mycket kunnande saknas fortfarande om mekanismer och den sekvens av förändringar som uppträder och i värsta fall får kulminera i fulminant multipel organsvikt. Värdet av kunskaper om underliggande patofysiologi kan inte nog understrykas, i synnerhet som dessa potentiellt kan erbjuda nya möjligheter till profylax och terapi. Tyvärr har mycket få behandlingar kunnat visa förbättrad överlevnad i den kliniska situationen med kritisk intensivvårdskrävande sjukdom. Nya studier med prövning av steroider, antikoagulantia och immunonutrienter som singelbehandling eller i kombination planeras. En framtida tänkbar behandlingsstrategi kommer med stor sannolikhet att vara multimodal, dvs en kombination av behandlingar med olika angreppspunkter. För att denna också skall vara kliniskt tillämpbar krävs att vi får förbättrade möjligheter att monitorera det inflammatoriska svaret hos våra patienter.

• author: Olanders, Knut
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Tönnesen, Else, Aarhus, Denmark
• organization: Department of Clinical Sciences, Lund
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Surgery
• keywords: traumatology, Kirurgi, ortopedi, traumatologi, orthopaedics, Surgery, inflammation, cytokine, leukocyte, reperfusion, ischemia, permeability, Intestine, endothelium
• pages: 178 pages
• defense location: Lecture room 3, Main building, Lund University Hospital
• defense date: 2003-11-27 10:15:00
• ISBN: 91-628-5881-5
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Olanders K, Sun ZW, Börjesson A, Dib M, Andersson E, Lasson Å, Ohlsson T, Andersson R. The effect of intestinal ischemia and reperfusion injury on ICAM-1 expression, endothelial barrier function, neutrophil tissue influx and protease inhibitor levels in rats. Shock 2002; 18:86-92. Article: II. Olanders K, Börjesson A, Zhao X, Wang XD, Andersson R. The influence of intestinal ischemia and reperfusion on tissue TNF-a and MCP-1 levels in rats. Submitted for publication. Article: III. Olanders K, Börjesson A, Sun ZW, Andersson R. Protective effects of N-Acetyl-L-Cystein and platelet activating factor inhibition are not linked to intercellular adhesion molecule-1 expression after intestinal ischemia and reperfusion in rats. Scand J Gastroenterol 2003; 38:618-25. Article: IV. Sun ZW, Olanders K, Lasson Å, Dib M, Annborn M, Andersson K, Wang X, Andersson R. Effective treatment of gut barrier dysfunction using an antioxidant, a PAF-inhibitor, and monoclonal antibodies against the adhesion molecule PECAM-1. J Surg Res 2002; 105:220-233. Article: V. Olanders K, Börjesson A, Zhao X, Andersson R. Effects of anticoagulant treatment on intestinal ischemia and reperfusion injury in rats. Submitted for publication.
• id: 3b4a142d-752b-4933-a42b-5e783f9d9251 (old id 466351)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:35:28
• date last changed: 2018-11-21 20:59:38