Separation Methods in Membrane Proteomics -Integration of Aqueous Two-Phase Partitioning for Enrichment and Pre-Fractionation

Abstract

The study of the protein complement of a genome is called proteomics. Proteomics can be defined as identification, quantification and characterization of a total set of proteins expressed at different time-points or under different cellular states to provide global information about biological processes. The study of membrane proteins is a challenging area in the development of proteomic research. Despite their importance in biology and medicine, membrane proteins are remarkably underrepresented in the majority of current proteomic studies, which is largely due to poor solubility in aqueous solutions and thus incompatibility with the traditional separation method, two-dimensional gel electrophoresis. This stresses the need for finding efficient strategies for enrichment and pre-fractionation, and development of novel high-resolution separation techniques for progress of membrane proteomics.



In this thesis, aqueous two-phase partitioning has been studied for enrichment and pre-fractionation of proteins to facilitate membrane proteomes analysis. Aqueous two-phase partitioning is a method used in different bioseparation applications for initial recovery of biomolecules mainly based on their surface properties. A number of different aqueous two-phase systems have been used and evaluated with a wide variety of proteomic separation and identification techniques. Detergent/polymer aqueous two-phase partitioning was shown to be efficient for pre-fractionation of yeast mitochondrial proteins. Furthermore, the structural integrity of multi-subunit membrane protein complexes was maintained in the detergent/polymer two-phase partitioning experiments. The importance of screening experimental conditions for optimized extraction of membrane proteins was demonstrated by the efficient and non-denaturing solubilization obtained by the combination of zwitterionic and non-ionic detergents. Metal affinity two-phase partitioning was investigated for selective enrichment of inner membrane vesicles from E. coli and provided a rapid enrichment compared to traditional sucrose gradient centrifugation. PEG/dextran two-phase partitioning was employed for rapid and efficient enrichment of plasma membranes from human peripheral blood mononuclear cells. The identification of a number of unique signature peptides derived from nine cell surface-specific CD-antigens showed that the proposed strategy can potentially be used for proteomic monitoring of disease reactions and therapeutic treatment on membrane bound cell surface proteins.



In conclusion, reduction of sample complexity is a key issue in all proteomic studies but especially so in membrane proteomics. The use of aqueous two-phase partitioning for enrichment and pre-fractionation combined with efficient high-resolution separation techniques will provide a useful approach for membrane proteins and membrane protein complexes in future proteomic studies.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Allt eftersom fler och fler organismers totala uppsättning gener, genomet, sekvenseras ökar fokus på att kartlägga de genprodukter, proteiner, som uttrycks. Att kunna studera de proteiner som uttrycks mer eller mindre vid olika tidpunkter eller cellulära tillstånd utgör en viktig del i sökandet efter kunskap om biologiska och medicinska processer. Studier av den totala uppsättningen av proteiner, proteomet, som uttrycks av ett genom kallas för proteomik. Proteomik delas ofta in i tre övergripande delar: separation, identifiering och kvantifiering av de ingående proteinerna. Den traditionella metoden för proteinseparation är två-dimensionell gelelektrofores och för identifiering används masspektrometri och bioinformatik. Två-dimensionell gel-elektrofores, där proteiner separeras enligt laddning i första dimensionen och enligt storlek i andra dimensionen, utgör ett viktigt redskap för studier av den vattenlösliga delen av ett proteom och är med sin höga kapacitet för separation av komplexa proteinblandningar en hörnsten inom proteomik-forskning. Dock kan denna metod inte separera alla olika sorters proteiner som ingår i ett proteom och att finna och utveckla alternativa separationsmetoder för att inkludera proteiner från alla klasser för en fullständig blick över de biologiska processer som utförs i cellen.



Denna avhandling adresserar problemet med en stor och viktig del av proteomet, nämligen separation av membranproteiner. Membranproteiner utgör ungefär en trdjedel av proteomet och utför en rad vitala processer i cellen såsom att upprätthålla nivån av viktiga ämnen inuti cellen, ta emot signaler från sin omgivning genom receptorproteiner i membranet och dessutom generera en stor del av cellens energi. Om fel inträffar i dessa processer blir resultatet att cellens prestationsförmåga försämras med sjukdom som följd. Det faktum att ~70% av idag kända målmolekyler för läkemedel utgörs av membranproteiner understryker vikten av att kunna studera dem i detalj för att finna fler och effektivare läkemedel i framtiden.



I denna avhandling har fokus varit på anrikning och förberedande uppdelning av membranproteiner inför högupplösande separation, identifiering och kvantifiering. En specifik fraktioneringsmetod som använts i olika utföranden är fördelning av proteiner i vattenhaltiga tvåfas-system. Denna metod är baserad på att strukturellt olika komponenter separerar till distinkta faser om de blandas i tillräckliga koncentrationer. Partiklar kan sedan distribueras mellan dessa två faser framför allt beroende på yt-egenskaper såsom laddning, hydrophobicitet, eller specifik affinitet. Med hjälp av sådan fördelning kan anrikning av målmolekylen ske genom avskiljning från det oönskade materialet. Anrikning av membraner och membranproteiner i just sådana tvåfassystem kombinerat med en rad olika tekniker för hög-upplösande separation och identifiering har här studerats.



Då membranproteiner inte är lösliga under traditionella betingelser krävs amfifila kemikalier, detergenter, för att extrahera dem från den hydrofoba miljön i det inre av membranen och hålla dem lösliga under vattenbaserade förhållanden (solubilisering). Vikten av att undersöka experimentella förhållanden vid solubilisering visades genom att studera fem olika detergenter. Effektiv solubilisering kunde uppnås vid optimal detergentkoncentration i förhållande till mängden protein i lösningen. Denna solubilisering visade sig också vara kompatibel med efterföljande anrikning i vattenhaltiga tvåfassystem bestående av en detergentfas och en polymerfas. Många detergenter kan användas för att bilda tvåfassystem med olika polymerer vilket har utnyttjats för att anrika membranproteiner i den hydrofoba detergentfasen genom att avlägsna vattenlösliga proteiner till polymerfasen. Här visas också att denna fördelning går att justera genom att introducera laddningar till tvåfassystemet vilket resulterar i en elektrostatisk repulsion av negativt laddade vattenlösliga proteiner till polymerfasen och därmed en större anrikning av membranproteiner i detergentfasen. Den optimerade solubiliseringen tillsammans med detergent/polymer tvåfasfördelning utgör en mild strategi för anrikning av membranproteiner och membranproteinkomplex bestående av både hydrofoba och hydrofila komponenter.



Fördelning i vattenhaltiga tvåfassystem har även använts för anrikning av intakta membraner. Affinitet användes för att selektivt fördela bakteriella membraner i tvåfassystem bestående av två polymerer. Ett membranbundet transportprotein modifierades genetiskt för att uttrycka en extra aminosyrasekvens som kan användas för upprening med hjälp av metallaffinitet. Genom att fördela allt material till överfasen för att sedan sätta till affinitetsligander bundna till en gelmatris och selektivt omfördela de önskade membranen till underfasen kunde en anrikad fraktion uppnås.



I en inledande studie av patienter med björkpollenallergi användes tvåfas-fördelning för att isolera en upprenad fraktion cellmembraner från en blandning av immunceller. Ett antal kända ytmarkörproteiner kunde identifieras och en strategi baserad på fyra steg, där tvåfasfördelningen utgör ett, kunde postuleras. Preliminära resultat visar att ett antal potentiellt unika markörpeptider kan detekteras som kan användas för att kvantifiera olika ytspecifika proteiners uttryck i samband med pollensäsong. Sådana kunskaper kan sedan användas för att finna förklaringar till de processer som utgör allergisk respons och hur cellen svarar på behandling med potentiella botemedel.



Sammantaget så visar resultaten som presenteras i denna avhandling på att fördelning i vattenhaltiga tvåfas-system är en lämplig metod för initial anrikning av membraner och membranproteiner inom framtida proteomstudier.

• author: Everberg, Henrik
• supervisor: Folke Tjerneld
• opponent: PhD Thömmes, Jörg, biogen idec Inc, Oceanside CA, USA
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2005
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Membrane proteins, Proteins, metabolism, Biokemi, Metabolism, Biochemistry, Aqueous two-phase partitioning, enzymology, Proteiner, enzymologi, Proteomics
• pages: 150 pages
• defense location: Center for Chemistry and Chemical Engineering, Getingevägen 60
• defense date: 2005-09-16 13:15:00
• ISBN: 91-628-6589-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 0bad7402-e9ff-4a19-98b0-f9e4cb128c77 (old id 545220)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:59:06
• date last changed: 2018-11-21 21:01:57