Development of Adenoviral Vectors for Studying Hematopoietic Stem Cell Function

Abstract

Hematopoietic stem cells (HSCs) are defined by their capacity to self-renew and differentiate into all hematopoietic cell lineages. Postnatally, HSCs reside predominantly in the bone marrow and are relatively rare, but important cells because of their therapeutic potential in bone marrow transplantation protocols and in their involvement in the origin of certain leukemias. To study how various genetic programs govern the regulation of HSCs, replication deficient viral vectors, including adenoviral vectors, have been utilized for gene transfer and expression in normal and malignant hematopoietic progenitor and stem cells. Adenoviral vectors allow high levels of transient transgene expression, however, adenoviral transduction of hematopoietic cells has been hampered by low expression of the coaxackie and adenovirus receptor (CAR), which is the primary target cell receptor for adenovirus serotype 5 (Ad5). With the aim to increase adenoviral gene transfer into hematopoietic cells, we modified the versatile Ad5 based AdEasy-1 vector system to Ad35 tropism by switching the shaft and knob domain of the fiber to that of the Ad35 species, which utilizes CD46 as a primary receptor for target cell anchoring. By using this fiber re-targeted system, termed AdEasy-1/F35, we demonstrated that primary chronic lymphocytic leukemia (CLL) and chronic myeloid leukemia (CML) patient cells could be efficiently transduced compared to conventional Ad5 vectors. Furthermore, we demonstrated that human candidate HSCs with NOD/SCID repopulating capacity from cord blood were efficiently transduced with the Ad35 tropism vectors. Moreover, in order to study the self-renewal process of HSCs, we utilized the Ad35 tropism vectors as reporters for monitoring human telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression in human HSCs. Interestingly, increased hTERT expression was inversely correlated to the self-renewal capacity among primitive human hematopoietic cells and the hTERT reporter vector could be used to separate short-term from long-term repopulating human HSCs. In summary, we have developed a versatile adenoviral vector system with Ad35 tropism that can be used to transiently genetically modify normal and leukemic stem cells. This vector system can be used to study normal regulation of HSCs and has potential in the development of novel therapeutic approaches for malignant blood disorders.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Blodet innehåller några av de mest grundläggande komponenterna för mänskligt liv. Med hjälp av hjärtats pumpkraft transporterar röda blodkroppar ut syre från lungorna till de mest avlägsna delarna av kroppen via gradvis tunnare blodkärl. Livshotande blödningar stoppas via blodplättarnas koagulerande förmåga och läkande egenskaper, medan de vita blodkropparna bekämpar infektioner från virus, bakterier och andra parasiter. De mogna blodcellerna, varav ca en trillion (1012) st förbrukas varje dag, behöver kontinuerligt ersättas. Detta sker via en tillsynes outtömlig källa, blodstamcellerna. Alla mogna blodceller härstammar från blodstamcellerna, som via intermediära mognadsstadier bildar nya blodceller utan att själv förbrukas. Detta fenomen möjliggörs av att blodstamcellen har den i blodet unika förmågan att vid celldelning bibehålla åtminstone en dottercell som stamcell, så kallad självförnyande förmåga. Förmågan hos blodstamcellerna att kunna ge upphov till alla de mogna blodcellerna utan att själv förbrukas gör dem användbara för terapeutiska syften. Via benmärgstransplantationer innehållande ?friska? blodstamceller från donatorer till patienter med blodsjukdomar som t ex leukemi kan ett nytt livslångt ?friskt? blodsystem återskapas. Tyvärr är denna behandling förknippad med stora risker, relaterade till att det ?nya? blodsystemets immunförsvar i många fall inte är kompatibelt med ytproteiner på patientens kroppsegna celler och attackerar dem. Dessutom har man nyligen funnit att många leukemiformer uppkommer från genetiska förändringar i friska blodstamceller, vilket skapar leukemistamceller som kontinuerligt producerar maligna blodceller med förödande konsekvenser för patienten. Eftersom dessa leukemistamceller är mycket snarlika friska blodstamceller har det visat sig vara mycket svårt att utveckla behandlingsformer som särskiljer de båda. För att förbättra benmärgstransplantationerna som terapiform, samt för att utveckla nya mer målinriktade terapiformer mot leukemistamceller, är det av yttersta vikt att först förstå funktionen av friska blodstamceller på en molekylär nivå. Ett utmärkt verktyg för detta ändamål är att använda modifierade virus som bärare (vektorer) och expressionsverktyg för gener i celler. I avhandlingsarbetet utvecklade vi ett viralt vektorsystem genom att genetiskt förändra ett ytprotein i ett befintligt adenoviralt vektorsystem för en mer effektiv infektering av blodceller via en alternativ receptor på cellytan. Vi påvisade att detta vektorsystem kan ta sig in i humana blodstamceller på ett effektivt vis och uttrycka sitt genetiska material. Det utvecklade vektorsystemet användes sedan för att studera hur telomeras-genen uttrycks i blodstamceller, eftersom den har visats vara viktig vid självförnyelse av blodstamceller i möss, samt att ett icke-fungerande telomeras kan leda till en kollaps av hela blodsystemet. I motsats till det förväntade, observerade vi att telomerasuttrycket är lågt i de mest primitiva blodstamcellerna, medan celler som delvis tappat sin självförnyande förmåga hade en relativt hög telomerasaktivitet. Denna upptäckt kan användas för att prospektivt separera de mest primitiva blodstamcellerna från mer mogna stamceller som delvis förlorat sin självförnyande förmåga, vilket potentiellt kommer att underlätta framtida studier på dessa celltyper. Sammanfattningsvis har vi i detta avhandlingsarbete utvecklat ett nytt viralt verktyg för humana blodceller och blodstamceller i synnerhet som kan användas främst i experimentella syften, men potentiellt också i framtida kliniska applikationer. Sedan dess publicering har ett 30-tal internationella forskargrupper efter förfrågan erhållit detta vektorsystem, vilket förhoppningsvis kommer att avspegla sig i framtida vetenskapliga framsteg.

• author: Järås, Marcus
• supervisor: Xiaolong Fan
• opponent: PhD Naldini, Luigi, Vita-Salute San Rafaele University, Milano, Italy
• organization: Department of Laboratory Medicine
• publishing date: 2006
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: Hematologi, extracellulära vätskor, extracellular fluids, hTERT, adenovirus, hematopoietic stem cells, Haematology
• pages: 104 pages
• defense location: Segerfalksalen Wallenberg Neurocentum BMC-A10
• defense date: 2006-09-22 09:00:00
• ISBN: 91-85559-15-6
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Marcus Nilsson, Johan Ljungberg, Johan Richter, Thomas Kiefer, Mattias Magnusson, André Lieber, Bengt Widegren, Stefan Karlsson and Xiaolong Fan. 2004. Development of an Adenoviral Vector System With Adenovirus Serotype 35 Tropism; Efficient Transient Gene Transfer Into Primary Malignant Hematopoietic Cells J Gene Medicine, vol 6 pp 631-641.; Marcus Nilsson, Stefan Karlsson and Xiaolong Fan. 2004. Functionally Distinct Subpopulations of Cord Blood CD34+ Cells Are Transduced by Adenoviral Vectors With Serotype 5 or 35 Tropism Molecular Therapy, vol 9; Marcus Järås, Anna Edqvist, Johan Rebetz, Leif G Salford, Bengt Widegren and Xiaolong Fan. 2006. Human Short-term Repopulating Cells Have Enhanced Telomerase Reverse Transcriptase Expression Blood, vol 108 pp 1084-1091.
• id: 00dd18fb-3c08-4e39-a2eb-af4927fe854a (old id 547134)
• date added to LUP: 2016-04-01 17:03:00
• date last changed: 2018-11-21 20:46:14