NMR STUDIES ON STRUCTURE AND DYNAMICS OF TWO-DOMAIN PROTEINS

Abstract

The general objective of the present thesis work was to examine 3-dimensional structure as well as the motional properties of two different types of two-domain proteins by solution-state NMR. One of the major tasks of this thesis work was to investigate the domain orientation of these molecules by employing residual dipolar couplings (RDC) which can be used as orientational restraints for increasing the accuracy of protein structures determined by NMR.



In the first paper of this thesis two neighboring Epidermal Growth Factor modules (EGF) of Protein S were investigated. Protein S is a down-regulator of blood coagulation and possesses 4 tandem EGF domains. The structure determination of EGF3-4 [Protein Data Bank accession code: 1z65c], employing RDCs, suggests that there is a hinge-like motion in EGF 3, which results in a bending of the structure. This is a unique and so far unprecedented fold of an EGF module.



The second paper deals with the structures of human and porcine Beta-Microseminoprotein, MSP, alternatively called Prostatic Secretory Protein of 94 amino acids, PSP94. The structures of the two proteins from these organisms were shown to be very similar [Protein Data Bank accession codes: 2iz3 and 2iz4]. MSP comprises two distinct beta-sheet domains. MSP adopts an extended structure, as determined by employing three different types of RDCs in the structure calculations. This result is in contrast to a recently published structure of porcine MSP (Wang et al. 2005, Journal of Molecular Biology, 346, 1071-1082; Protein Data Bank accession code: 1xhh), where the domains are arranged in a compact conformation. Structure validation showed that the usage of only one type of RDCs cannot solely discriminate between the two different domain orientations.



In a subsequent study 15N relaxation data of human and porcine MSP were measured and compared. Model-free analysis of the heteronuclear relaxation data (R1, R2 and steady state NOE of the backbone {1H}-15N) was used to extract information on the dynamics of the proteins. The dynamical information obtained by this method reports on both the overall tumbling and the internal motion of human and porcine MSP. The data show that the human variant of MSP is more flexible than its porcine counterpart. A combination of CPMG and R1,rho experiments was employed to characterize the chemical exchange contribution to R2 for residues of human MSP. It was shown that in human MSP backbone amide nitrogens of at least two residues, Glu31 and Tyr43, experience chemical exchange on a timescale of 0.2 ms.



It has recently been shown that human MSP binds to two blood plasma proteins, CRISP-3 ("Cysteine RIch Secretory Protein-3"; Udby et al. 2005, Biochemical and Biophysical Research Communications, 333, 555-561) and PSPBP ("PSP94-Binding Protein"; Reeves et al. 2005, Biochemical Journal, 385, 105-114). Based on the crystal structure of stecrisp, which is a CRISP-3 homologous protein, and NMR data for a 1:1 mixture of human MSP and human CRISP-3, a model for the protein complex is presented in the last paper of this thesis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Jag har under min forskarutbildning vid Lunds tekniska högskola studerat proteiner med hjälp av en metod som kallas kärnmagnetisk resonans, NMR.



I levande organismer regleras allt liv av tre typer av molekyler: DNA, RNA och proteiner. Den centrala dogmen i biokemi "DNA-RNA-Protein" innebär att den genetiska kod som ärvs i form av DNA och som finns i varje cell i kroppen, kopieras till budbärar-RNA, vilket i sin tur översätts till ett protein. Processen där genkopian RNA skapas kallas för transkription. RNA innehåller de kodande informationsbitarna av den gen som ska användas för tillverkning av ett visst protein. Översättningen från RNA till protein sker via ett förlopp kallat translation. Generna i DNA kodar för tiotusentals olika proteiner. Proteiner utför en rad olika och livsviktiga uppdrag i kroppen, vilket gör livet möjligt. Bland annat är proteiner byggstenar och transportörer av syre, elektroner och näringsämnen. De agerar som signalsubstanser (hormoner) och försvarar kroppen mot inkräktande bakterier och främmande ämnen (antikroppar). Proteiner sitter på cellernas ytor och fungerar som mottagare av signaler (receptorer). De utgör kanaler i cellens membranväggar eller agerar som enzymer som påskyndar kemiska reaktioner.



Hur fungerar NMR? Kärnans egenskap: Metoden bygger på att vissa atomkärnor har en kvantmekanisk egenskap som kallas för spinn. För vissa typer av atomkärnor ger denna egenskap upphov till ett magnetiskt moment hos kärnan och kärnan beter sig då som en liten magnet med två poler. En atomkärna som har spinn och som naturligt ingår i de levande organismers biomolekyler är väteatomens kärna. Inom NMR utnyttjar man atomkärnornas spinnegenskap genom att placera atomkärnorna i ett starkt magnetfält. Denna stora magnet är normalt tiotusentals gånger starkare än jordens magnetfält. Tittar vi till exempel på väteatomers kärnor i ett kroppseget protein som placerats i en spektrometer, som består av ett starkt statiskt magnetfält, kan vi, lite förenklat, säga att dessa atomkärnors magnetiska poler kommer att ställa sig antingen parallellt med eller anti-parallellt mot det yttre magnetfältets riktning. De kärnor som har sina poler parallella med det yttre magnetfältets riktning kommer att ha aningen lägre energi än de kärnor som ställer sig anti-parallellt. Det blir ett litet överskott av de atomkärnor som befinner sig i det lägre energitillståndet och därmed produceras en nettomagnetisering som är riktad parallellt längs med yttre magnetens riktning. En annan konsekvens av det pålagda magnetiska fältet är att atomkärnornas magnetiska moment kommer att rotera, precessera, kring axeln på det stora magnetfältet med en viss frekvens, kallad Larmor-frekvens. Men på grund av att alla atomkärnor inte är perfekt riktade kommer denna rotation inte att vara samstämmig. Man brukar säga att kärnornas magnetiska dipolmoment inte precesserar i fas.



Användning av radiofrekvensvågor i NMR: Genom att bestråla kärnorna med elektromagnetiska vågor i radiofrekvensområdet (MHz), kommer man att tillföra energi till systemet så att de kärnor som har lägre energi får en knuff upp till det högre energitillståndet. Systemet tar upp energi. En effekt av att applicera radiofrekvensen, under en viss tid och vinkelrät mot stora magnetfältets riktning, är att den nettomagnetisering som hade skapats fälls ner så att den kommer ner i xy-plan. Dessutom skapas ett förhållande som kallas för koherens, dvs de magnetiska moment som precesserade slumpmässigt kommer nu att precessera med samma fas. Projektionen av magnetisering i xy-plan samt den samstämmiga, koherenta, rotationen i xy-plan ger upphov till en växelström i en slinga som är placerad runt provet. På så sätt kan en NMR-signal som innehåller information om atomkärnans omedelbara närhet uppfångas.



När man sedan avslutar bestrålningen (ca några milliondelars sekund senare) kommer systemet att så småningom återgå till sitt jämviktsläge, alltså samma tillstånd som rådde innan elektromagnetiska bestrålningen började. I och med detta dör NMR-signalen ut. Detta kallas för "free induction decay", eller kort, FID. FID registreras och behandlas matematiskt i en dator för att kunna omvandla den information som finns i tidsdomän till information i frekvensdomän. I ett protein har olika kärnor olika frekvenser pga att det lokala magnetiska fält som de upplever är olika, beroende på var i proteinet de är placerade.



Vad kan man göra med NMR inom biokemi? NMR möjliggör studier av små molekyler och man får information på atomnivå. Med hjälp av NMR kan man bestämma ett proteins 3-dimensionella struktur och få en detaljerad karta över dess rörelser. För ett protein kan strukturen vara viktig för växelverkan med andra molekyler och rörelsen kan vara en essentiell mekanism som proteinet utnyttjar för att utföra sina uppgifter - denna uppgift kan vara katalys av en viss kemisk reaktion eller in- och utpumpning av joner in till eller ut från en cell.



Varför vill man studera proteiner? Att kunna kartlägga strukturen är också en viktig del i sökandet kring sambandet mellan ett proteins struktur och dess funktion. Den ultimata utmaningen är att kunna formulera en algoritm med vars hjälp vi kan uttyda makromolekylers struktur och topologi redan utifrån den genetiska kod som finns i DNA. På så sätt hoppas man i framtiden kunna förutsäga hur ett protein som en viss gen uttrycker ser ut och därmed vilken funktion proteinet har. Genom modifiering eller reglering av dessa gener skulle vi kunna bota protein-relaterade sjukdomar med hjälp av genterapi i framtiden.



Det som är realistiskt idag är att med hjälp av struktur- och dynamikstudier söka förstå de bakomliggande orsakerna till att vissa proteiner blir sjukdomsalstrande. Abnormiteter hos proteiner kan leda till exempelvis prion-sjukdomar som Jakob Creutzfeldt sjukdom eller sickle cell-anemi. För att kunna råda bot på protein-relaterade sjukdomar måste vi få insyn i proteinernas värld och söka genomskåda de mekanismer som gör att proteiner kan fungera på rätt sätt. Att studera proteiner är således inte enbart en akademisk frågeställning, utan är högst relevant för samhället och människan.



Vilka proteiner har jag studerat?



EGF-moduler av Protein S.



Protein S är ett anti-koagulationsprotein som finns i blod. Detta protein hjälper till att avbryta koaguleringen av blod när blodet levrat sig och ett sår slutat att blöda. Det är livsviktigt att koaguleringen stoppas i tid för att vi inte ska riskera att allt blod ska levra sig till en geléaktig massa. Protein S har fyra så kallade EGF-moduler. Namnet har de fått från att deras struktur är nära släkt med Epidermal Growth Factor, ett hormon som bland annat reglerar cell-tillväxt i kroppen. Dessa moduler är enheter som består av ca. 45 aminosyror vardera. Genom våra studier kunde vi visa att det förekommer en gångjärnsliknande rörelse i dessa moduler. Möjligtvis är denna rörelse relevant för proteinets kalciumbindning eller funktion.



MSP.



Proteinet Beta-Microseminoprotein, MSP, som ursprungligen isolerades från sädesvätska, har visat sig finnas i andra körtelvävnader i kroppen och återfinns i lika stor mängd i blodet hos kvinnor som hos män (Abrahamsson et al., 1989, Clinical Chemistry, 35, 1497-1503). Humant MSP består av 94 aminosyror och kallas ibland för "Prostatic Secretory Protein of 94 Amino Acids" eller "PSP94". MSP är exempel på ett snabbt evolverande protein och har många mutationer samt stor sekvensmångfald inom proteinfamiljen. Proteinets funktion är dock inte känd. En forskargrupp har föreslagit MSP som markör för prostatacancer (Tsurusaki et al., 1998, Prostate, 35, 109-116) och i Kanada har en annan grupp visat att proteinet hämmar tumörtillväxt (Shukeir et al., 2004, Cancer Research, 64, 5370-5377).



Vår forskargrupp bestämde den 3-dimensionella strukturen hos MSP från gris och människa med hjälp av NMR och vi fann att proteinet har en unik veckning, som aldrig tidigare påvisats hos något annat protein. Det visade sig att strukturerna av MSP från människa och gris är väldigt likartade trots att aminosyrasekvensen skiljer sig med 50 procent mellan de två arterna. Detta tyder på att strukturen är viktig för MSP:s funktion. Vi studerade dessutom dynamiken av MSP och fann att människans MSP har två aminosyror som uppvisar rörelse på en tidsskala av millisekunder. Dessa två aminosyror är nära varandra i den 3-dimensionella strukturen. Rörelser på millisekundskala är ofta kopplade till proteiners funktion, till exempel enzymatisk katalys.



Genom upptäckten att andra proteiner, CRISP-3 (Cysteine RIch Secretory Protein) och PSPBP (PSP94-Binding Protein), vilka också finns i blod och saliv, binder till MSP blev det möjligt att studera inbindningen och i detalj kartlägga bindningssätet. Dessa resultat är relevanta för de forskare som ska studera dessa proteiner i medicinskt sammanhang. Både Protein S och MSP-projekten har varit resultaten av ett långvarigt samarbete med Johan Stenflo och Per Fernlund på avdelningen för klinisk kemi på Malmös allmänna sjukhus, MAS.

• author: Ghasriani, Houman
• supervisor: Torbjörn Drakenberg
• opponent: Professor Karlsson, Göran, NMR Centre, Gothenburg University
• organization: Biophysical Chemistry
• publishing date: 2007
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Physical Chemistry
• keywords: Fysikalisk kemi, Biochemistry, Metabolism, Biokemi, metabolism, Physical chemistry, Molekylär biofysik, CRISP-3, NMR, 3D-structure, NMR relaxation, Molecular biophysics, Prostate cancer, EGF module, PSP94, Beta-microseminoprotein, Protein S
• pages: 114 pages
• defense location: Lecture hall C, Chemical Centre, Getingevägen 60, Lund, Sweden
• defense date: 2007-05-31 10:30:00
• ISBN: 978-91-7422-159-6
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Torbjörn Drakenberg, Houman Ghasriani, Eva Thulin, Ann-Marie Thämlitz, Andreas Muranyi, Arto Annila and Johan Stenflo. 2005. Solution Structure of the Ca2+-Binding EGF3-4 Pair from Vitamin K-Dependent Protein S: Identification of an Unusual Fold in EGF3 Biochemistry, vol 44 pp 8782-8789. Media-Tryck, Lund; Houman Ghasriani, Kaare Teilum, Ylva Johnsson, Per Fernlund and Torbjörn Drakenberg. 2006. Solution Structures of Human and Porcine Beta-Microseminoprotein J. Mol. Biol., vol 362 pp 502-515. Media-Tryck, Lund
• id: b82535e7-827c-4c02-b32a-560566a29fac (old id 548683)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:04:09
• date last changed: 2018-11-21 21:02:27