Influence of cisplatin on RNA structure in solution Escherichia coli tRNA(Ala) and human Wnt-5a 3' UTR model system studies

Abstract

RNA molecules in the cellular environment have several important functions. In many cases, proper RNA function is intimately linked to proper three-dimensional structure of the molecule. Thus, it seems reasonable to assume that structural changes caused by external influence can strongly inhibit important cellular functions maintained by RNAs. Studies in this thesis have had a focus on the influence of the anticancer drug cisplatin and its effect on RNA structure in solution. Consequences of the structural distortions caused by platination, were studied in two model systems i) Escherichia coli tRNAAla, and ii) the human Wnt-5a 3? UTR. Chemical and enzymatic probing techniques were used to document the preferred and specific location for interactions of cisplatin with the RNA, and also the structural changes resulting from these interactions.



The tRNA models used for structural probing were based on the synthetically prepared tRNAAla together with truncated models based on the acceptor stem and anticodon seuquences, respectively. Functional studies were carried out by use of the aminoacylation reaction maintained by Escherichia coli alanyl-tRNA synthetase (AlaRS). The enzyme was cloned in Escherichia coli M15(pREP4) strain and purified with chelating chromatography in one step.



The second target used in this work represents a model of an AU rich region corresponding to the initial 260 bases of the Wnt-5a 3? UTR. To detect functional perturbations after platination, the effect of cisplatin on protein expression was investigated with a reporter vector containing the Wnt-5a 3? UTR coupled to the luciferase reporter gene (pcDNA3-Luc/W-UTR(1-259)).



The studies show that cisplatin-RNA adduct formation takes place with a rate comparable to that of DNA-binding, but with an adduct formation profile that seems to be influenced by the structure of the targeted RNA. If accessible, GG-sequences seem to be preferentially platinated. However, subtle variations of the flanking sequences have a profound influence on the nature of the final adduct. Further, platination was shown to have a significant influence on the resulting both structure and function, in the latter case for example illustrated by inhibition of the aminoacylation reaction. In conclusion, the data obtained supports the assumption of RNA as a biologically relevant target for cisplatin and related metal-based drugs, which may operate in parallel with already established ones on the DNA-level.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Studierna i denna avhandling behandlar hur anticancer preparatet cisplatin påverkar RNA strukturen. För att visa att strukturella förändringar kan hämma viktiga funktioner i cellen har två RNA modellsystem valts i) tRNAAla (specifikt för aminosyran alanin) från bakterien Escherichia coli och ii) en modell som representerar ett humant proteins 3' UTR (untranslated region) RNA sekvens.



RNA (ribonukleinsyra)



RNA molekylen är närbesläktat med DNA (deoxiribonukleinsyra) molekylen, ett släktskap som grundar sig på deras liknande kemiska uppbyggnad. Båda molekylen bildar långa sammanlänkande nukleosider med fosfatlänkar, som i sin tur sammanfogas till dubbelsträngade eller hårnålsliknande enkelsträngade makromolekyler. Nukleotider är uppbyggda av en kvävebas och en sockermolekyl (deoxiribos i DNA, ribos i RNA) och en fosfatgrupp. Grunden till bindningarna utgörs mellan både två olika strängar och inom en enkelsträng av kvävebasernas funktionella atomer. De fyra förekommande kvävebaserna adenin (A), tymin (T), (uracil (U) istället för tymin i RNA molekylen), guanin (G) och cytosin (C), binder parvis och specifikt till varandra med vätebindningar. RNA molekyler är väldigt känsliga jämfört med DNA för degradering genom hydrolys av bindningen mellan nukleotiderna på grund av det reaktiva hydroxylgruppen på sockermolekylen (ribos). I DNA jämfört med RNA är samma position ockuperad av en väteatom. Olikheten mellan DNA och RNA, förutom den kemiska differensen, ger sig till uttryck i deras funktion och struktur. RNA kan anta väldigt komplexa och kompakta tre dimensionella strukturer jämfört med DNA och de specifika strukturerna är strikt relaterade till funktionen. DNAs viktigaste funktion är att lagra den genetiska koden. Den genetiska koden (kombinationen av de fyra kvävebaserna) ansvarar för uppbyggnad av cellens olika proteiner som i sin tur reglerar och katalyserar kemiska reaktioner i cellen. Överföringen av informationen som är lagrat i koderna utförs av RNA molekyler. Informationen om en proteins sekvens överförs från DNA med hjälp av mRNA (budbärar-RNA). Förutom den kodande sekvensen bär mRNA så kallade



UTR sekvenser både uppströms (5') och nedströms (3') av den kodande regionen och som inte översätts till proteinsekvenser. UTR sekvensen reglerar mRNA stabiliteten och därmed även dess uttryck till proteiner. Utöver sin budbärarfunktion kan olika RNA transportera aminosyror i cellen och koordinera funktioner mellan cellkärna och cytosolen (cellvätska innehållande proteiner och organeller). tRNA (transport RNA) har sin specifika funktion i att transportera aminosyror, som är byggstenar för proteiner, till cellens proteintillverkande komplex (ribosomen). De 20 mest vanligt förekommande aminosyrorna bildar komplex specifikt med tillhörande tRNA molekyl. Reaktionen för komplexbildningen mellan aminosyra och det matchande tRNA utförs av enzymet aminoacyl-tRNA syntetas (aaRS). Den specifika parbildningen mellan aminosyran och tRNAt är strikt reglerad av tRNA strukturen, och är viktigt för att inte infoga fel i den växande proteinsekvensen vid ribosomen.



Cisplatin, cis-PtCl2(NH3)2



Cisplatin började användas för mer än 20 år sedan i cancerterapi i kombination med andra cytostatika och behandlingsmetoder. Det mest effektiva resultatet i dag, med mer än 90% överlevnad, har man uppnått i behandlingen av testikelcancer. Behandlingen med cisplatin av andra cancer former har också visat vara effektiv. Cisplatin hämmar celldelningen och upptäcktes av en ren tillfällighet när man ville studera hur bakteriers celldelning påverkades av elektriskt ström. I försöket använde man platinaelektroder i saltlösningen med bakterier. Senare har närmare analys visat att ämnet som påverkade cellernas tillväxt i försöket var just cisplatin. Cisplatin är en oorganisk molekyl med en platina atom i centrum som binder två par ligander, klor och ammonium i cis-konformation, därav namnet cisplatin. Flera detaljerade studier har kartlagt att cisplatin efter transporten genom cellmembranet tappar först den ena och sedan den andra av de två kloratomerna i jonform (Cl-) genom hydrolys, och de ersätts med två vattenmolekyler. Innan hydrolys är cisplatin en stabil och inaktiv förening. Förvandlingen till komplexet med vattenmolekyler medför att cisplatin får en eller två positiva laddningar och blir betydligt mer reaktiv. Den aktiva föreningen i cellen letar sig till negativt laddade molekyler. Den mest etablerade teorin i dag, som grundar sig på lång tids forskningsresultat, är att cisplatin efter passage genom cellmembranet primärt binder till arvsmassan (DNA) som är cellens



största negativt laddade molekyl. Cisplatin bildar komplex med DNA genom att vattenmolekylerna byts ut mot elektronpar-bindningar i första hand mellan två guanin kvävebaser och platinaatomen. Bindningen av cisplatin till DNA är irreversibelt (kemiskt stabilt) och förhindrar celldelningen för att ske på ett korrekt sätt och cellen dör istället (går i apoptos). Inga cytostatika inklusive cisplatin gör skillnad mellan de friska celler och tumörceller. Därför blir behandlingen med cisplatin, liksom med andra cytostatika, betungande med svåra biverkningar.



Slutsatser



RNA molekylen har teoretiskt likvärdig potential som DNA att bilda komplex med cisplatin. Resultat av sekvenseringsstudier i denna avhandling har visat att RNA bildar komplex med cisplatin som liknar cisplatin-DNA komplexet och att komplexbildningen resulterar i strukturförändringar. I denna avhandling har vi också visat att Escherichi coli tRNAAla i komplex med cisplatin har en förändrad fragmentering efter enzymatisk och kemisk klyvning. Det kan bero på att cisplatininbindningen påverkar tRNA molekylens rätta veckning. Vidare har studiet visat att cisplatin företrädesvis bildade komplex med den G-rika sekvensen i stamregionen vilken är viktig för igenkänning av tRNA syntetas enzymet. Även aktivitetsstudie av alanyl-tRNA syntetas (AlaRS) har visat att platineringen påverkar funktionen. Studiet har visat att AlaRS hämmas i sin funktion att överföra aminosyran alanin till den platinerade tRNA molekylen in vitro. Andra studier i avhandlingen har visat att cisplatin-RNA komplexets karaktär är relaterad till RNA strukturen. Reaktionshastigheten för att bilda cisplatin-RNA komplex har visat sig vara något snabbare jämfört med DNA för det korta hårnålsmodeller som har studerats med kinetik. Studier har också visat att RNA molekyler i komplex med cisplatin är mindre känsliga för degradering. Det senare är ett resultat som skulle kunna vara viktigt för utvecklingen av framtida RNA baserade läkemedel som till exempel siRNA i komplex med cisplatin. Sammanfattningsvis har resultatet i denna avhandling visat att det bör finnas ett särskilt intresse i framtiden för att göra uppföljande studier, som är relaterade till konsekvenser av cisplatininteraktionen med RNA som till exempel i behandlingen av cancer.

• author: Papsai, Pal
• supervisor: Sofi Elmroth
• opponent: Prof. DeRose, Victoria, University of Oregon, USA
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2007
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Biokemi, metabolism, Proteins, enzymology, Proteiner, enzymologi, Metabolism, Biochemistry, Naturvetenskap, Natural science, tRNA., siRNA, probing RNA structure in solution, alanyl-tRNA synthetase, cisplatin
• pages: 184 pages
• defense location: Sölvegatan 39, Kemicentrum Hörsal E
• defense date: 2007-11-02 09:30:00
• ISBN: 978-91-7422-178-8
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ac912ee8-5bf5-4c1f-8351-8b183573ca97 (old id 599080)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:35:37
• date last changed: 2018-11-21 21:05:52