Advanced

Proteinase 3 and Neutrophil Apoptosis in ANCA-Associated Systemic Vasculitis

AbdGawad, Mohamed LU (2010) In Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series 2010:95.
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Ordet vaskulit betyder kärlinflammation och med systemisk vaskulit menas inflammation i blodkärl på flera olika ställen i kroppen. Vaskulit kan drabba alla typer av kärl i kroppen, både stora och små, artärer, vener och kapillärer. Inflammationen i kärlväggen kan leda till att kärlet skadas och att blodförsörjningen till olika organ då kan bli bristfällig. Symtomen vid vaskulit beror helt på vilket/vilka organ som påverkas.

ANCA står för anti-neutrofila cytoplasmiska antikroppar. Detta är antikroppar riktade mot proteiner som finns inuti vita blodkroppar. Antikroppar känner alltså igen kroppens egna proteiner och kallas därför auto-antikroppar. De vanligaste målen för ANCA är proteinas 3... (More)
Popular Abstract in Swedish

Ordet vaskulit betyder kärlinflammation och med systemisk vaskulit menas inflammation i blodkärl på flera olika ställen i kroppen. Vaskulit kan drabba alla typer av kärl i kroppen, både stora och små, artärer, vener och kapillärer. Inflammationen i kärlväggen kan leda till att kärlet skadas och att blodförsörjningen till olika organ då kan bli bristfällig. Symtomen vid vaskulit beror helt på vilket/vilka organ som påverkas.

ANCA står för anti-neutrofila cytoplasmiska antikroppar. Detta är antikroppar riktade mot proteiner som finns inuti vita blodkroppar. Antikroppar känner alltså igen kroppens egna proteiner och kallas därför auto-antikroppar. De vanligaste målen för ANCA är proteinas 3 (PR3) och myeloperoxidas (MPO). PR3 är ett protein med kapacitet att bryta ner andra proteiner, men PR3 har dessutom en rad andra egenskaper som påverkar immunförsvaret.

ANCA-associerad systemisk vaskulit (AASV) är en grupp inflammationssjukdomar som drabbar framförallt små kärl och kännetecknas av ANCA i blodet. Genom att mäta ANCA i blodet hos patienterna kan man lättare ställa diagnos vid dessa sjukdomar. AASV påverkar många organ i kroppen men framförallt njurarna och lungorna. Njurarna har en riklig blodförsörjning med många små kärl. Skada på dessa kärl leder till att njurfunktionen blir sämre och i värsta fall i sådan utsträckning att patienten behöver dialysbehandling. Tidigare studier visar att ca 5 procent av alla patienter som får dialysbehandling har AASV som grundsjukdom. AASV kännetecknas av ansamlingar av döende neutrofiler i regioner med inflammation.

Neutrofiler är den vanligaste typen av vita blodkroppar (ca 60 % av alla vita blodkroppar) och representerar den första linjens försvar mot bakteriell invasion. Varje dag bildas 100 miljarder neutrofiler i benmärgen innan de släpps ut i blodbanan. Deras livslängd i blodbanan är kort, mellan 10 och 24 timmar. Vid infektion bildas tio gånger fler neutrofiler per dag, och de överlever ett par dagar längre. Vid bakteriell infektion, vandrar stora mängder neutrofiler ut ur blodkärlen till infektionshärden och bekämpar invasionen. Neutrofilers huvudfunktion är att äta upp mikroorganismer och döda dem. Neutrofiler dödar bakterier med hjälp av bakteriedödande substanser, bland annat PR3 och MPO, som lagras i små korn (granula). När bakterierna är bekämpade elimineras överflödet av neutrofiler annars kan deras bakteriedödande substanser skada omkringliggande vävnad. Detta kan ge en efterföljande inflammation, som kan ge upphov till allvarlig vävnadsskada och inflammatorisk sjukdom. Neutrofiler elimineras/äts upp av andra större celler, en annan typ av vita blodkroppar som kallas “makrofager”. För att kunna ätas upp av makrofager, måste neutrofilerna först begå spontant självmord, en process som kallas apoptos eller programmerad celldöd.

PR3 representerar en av de bakteriedödande substanser som lagras i neutrofilens granula. PR3 kan frisättas ur granula för att underlätta för neutrofilen att ta sig ut till den infekterade vävnaden och för att döda bakterier utanför neutrofilen. PR3 kan dessutom hittas på ytan (mPR3) hos en del av alla neutrofiler. Förekomsten av två olika delpopulationer, mPR3 negativa och mPR3 positiva neutrofiler, inom en individ kallas bimodalt membranuttryck. Andelen mPR3 positiva neutrofiler varierar från 0 till 100% hos olika individer, men är mycket stabilt i en viss person under längre perioder. Detta tyder på en genetisk bakgrund till fenomenet, och stöds bland annat av iakttagelser i familje- och tvillingstudier. Hur och varför PR3 associerar med membranet är fortfarande oklart. Vissa forskare föreslår att bindningen mellan PR3 och membranet är direkt d.v.s. att PR3 kan binda direkt till membranet, medan andra har funnit bevis på en receptor-medierad bindning. Olika membranbundna proteiner, receptorer, för mPR3 i neutrofiler har föreslagits, till exempel β2 integrin (CD11b/CD18), CD16b (FcγRIIIb) och scramblase1. Ingen av dessa molekyler uttrycks på alla neutrofiler och kan således inte förklara det bimodala membran-uttrycket för mPR3.

I det första delarbetet kunde vi visa att patienter med AASV har förhöjda nivåer av PR3 i plasma och högre nivåer av mPR3. Det faktum att både cirkulerande och membranbundet PR3 är förhöjt tyder på en gemensam mekanism. Vi har därför arbetat efter hypotesen att avvikande PR3/mPR3 nivåer kan vara en markör för en specifik funktionell defekt hos neutrofiler. Vi kunde också visa att denna defekt inte var en tidigare genetisk förändring i genen som kodar för PR3. Ett svagt men signifikant samband mellan plasma PR3 och mPR3 observerades i kontrollgruppen och MPO-ANCA-positiva patienter. Detta tyder på att avlägsnande av PR3 från membranet, åtminstone delvis, kan förklara ökningen av plasma nivåer av PR3 hos AASV patienter, men det är osannolikt att det är den enda mekanismen.

I det andra arbetet studerades varför PR3 endast hittas på cellytan hos en del av neutrofilerna. CD177 är den enda molekyl, förutom PR3, som är känd för att ha ett bimodalt membran-uttryck i neutrofiler. Vi kunde visa att mPR3 finns på samma undergrupp av neutrofiler som också är positiva för CD177. Dessutom visades att både CD177 och mPR3 regleras på samma sätt och att mPR3 frigörs från och rekryteras till membranet löpande, så att mängden av mPR3 på ytan av dessa mPR3 positiva neutrofiler är relativt konstant.

I delarbete tre visar vi att CD177 och mPR3 alltid hittas på samma neutrofiler hos alla individer, sjuka som friska. Den membran-PR3/CD177-positiva neutrofila subpopulationen var större hos AASV och Systemisk Lupus Erythematosus (SLE)– patienter än hos andra subgrupper av patienter och friska kontroller, vilket tyder på ett specifikt samband. CD177 är en markör för ökad bildning av neutrofiler i benmärgen och är förhöjd hos patienter med sjukdomar som kännetecknas av ökad neutrofilbildning. G-CSF eller GM-CSF är två signalproteiner (cytokiner) som stimulerar uttrycket av PR3 och CD177 på plasma membranet. Förhöjda nivåer av dessa signalproteiner skulle kunna förklara de förhöjda nivåerna av mPR3, men vi kunde bara hitta höga nivåer av dem i 4 av 51 AASV patienter.

Sambandet mellan mPR3 och CD177 undersöktes ytterligare genom att mäta avskrivningen av deras respektive gener. Avskrivningen av PR3 genen var högre hos AASV patienter än hos friska individer, men inget samband kunde visas till mängden mPR3. Däremot hittades ett tydligt samband mellan avskrift av CD177 genen och mPR3 nivåer. Genom att först sortera de mPR3 positiva och mPR3 negativa cellerna i två populationer och sedan mäta genavskriften kunde vi också visa att CD177 genen hade en förhöjd avskrivning i de mPR3 positiva cellerna medan PR3 genen var lika aktiv.

För att ytterligare karakterisera förhållandet mellan de två molekylerna gjordes ett försök där CD177 genen sattes in i odlade humana celler som normalt inte har CD177 på sin yta. Vi kunde då visa att endast de celler som uttryckte CD177 på cellytan kunde binda in PR3 till sin cellyta.

I det fjärde delarbetet undersöktes apoptoshastigheten i neutrofiler från patienter med AASV. Resultaten visade att neutrofiler från AASV hade en lägre spontanapoptoshastighet och längre överlevnad jämfört med neutrofiler från friska individer, SLE-patienter, och njurtransplanterade individer. En längre överlevnad observerades också hos neutrofiler från Polycytemia Vera (PV) patienter och reumatid artrit (RA) patienter. Fördröjd neutrofil apoptos har i andra studier associerats med andra kliniska tillstånd såsom sepsis, sömnapné, cystisk fibros, lunginflammation, idiopatisk lungfibros, systemisk inflammatorisk respons syndrom efter större trauma, inflammatorisk tarmsjukdom, och Kawasakis sjukdom. Således kan minskad apoptos i AASV vara en följd av kronisk inflammation. Vi kunde dock inte finna några samband mellan apoptoshastighet och andra kliniska parametrar för inflammation som till exempel sänkan.

Apoptoshastigheten kan påverkas av faktorer i plasman. Som nämnts ovan, kan G-CSF, GM-CSF men även signalmolekylen IL-3 öka neutrofil-överlevnaden och fördröja eller förhindra neutrofil-apoptos. G-CSF och IL-3 nivåerna var normala i plasma hos alla subgrupper i denna studie. Som nämnts ovan, var GM-CSF nivåerna högre än normalt i fyra av 44 AASV patienter. GM-CSF var också högre i 8 av 20 RA-patienter, vilket är intressant, då dessa åtta patienter hade en fördröjd neutrofil-apoptos, i förhållande till andra RA-patienter. Detta visar att mekanismerna bakom den långsamma apoptoshastigheten i AASV kan vara annorlunda än i RA.

Om neutrofiler uppvisar ökad känslighet för dessa cytokiner, skulle det ändå kunna förklara minskad neutrofil-apoptos. Denna hypotes har testats genom odling av neutrofiler med tillväxtfaktorer. Endast tre patienter hade en högre känslighet för GM-CSF/IL-3 än friska individer.

Tillväxtfaktorer är kända för att förlänga överlevnaden genom uppreglering av antiapoptotiska faktorer och nedreglering av proapoptotiska faktorer. Den minskade apoptosen i AASV och PV patienter i denna studie visade inte ha något samband med högre genavskrift av dessa faktorer. Den ökade mPR3/ CD177 positiva neutrofila subpopulation visade inte heller ha något samband med den långsammare apoptoshastigheten i AASV patienter, vilket tyder på att dessa fenomen kan ha olika ursprung.

En annan möjlig mekanism som kan bidra till en långsammare apoptoshastighet är förändringar i olika tillväxtfaktorers signalering. Nivån av genavskrift utav tre transkriptionsfaktorer som deltar i neutrofilbildningen (C/EBP-α, C/EBP-β och PU.1) var avsevärt högre hos AASV-patienter än hos friska individer, lägre i PV patienter, och oförändrad hos RA patienter och njurtransplanterade individer. Ett förhöjt uttryck av C/EBP-α, C/EBP-β och PU.1 i AASV neutrofiler kan leda till ökad känslighet för cytokiner. I själva verket kan dessa transkriptionsfaktorer ha en direkt positiv inverkan på neutrofilers överlevnad och nybildning, oberoende av G-CSF och GM-CSF och deras respektive receptorer.

Sammanfattningsvis ger denna avhandling bevis för en förändrad neutrofilfenotyp i samband med AASV. Ytterligare forskning om de mekanismer genom vilka neutrofiler överlever och hur apoptos regleras kommer att hjälpa oss att förstå patofysiologin vid AASV och vara till hjälp för design av ny avancerad diagnostik och behandling. (Less)
Abstract
ANCA-Associated Systemic Vasculitis (AASV) is characterized by leukocytoclasis- dying neutrophils surrounding small blood vessels. Previous studies have shown increased plasma PR3 and increased proportion of neutrophils expressing plasma membrane-associated PR3 (mPR3+).

Neutrophils were isolated by polymorphprep and membrane expression was measured by FACS. Plasma PR3, pro-PR3 and cytokines were measured by ELISA. Neutrophil apoptosis was measured by FACS after 20h in vitro culture. Expression of pro/anti-apoptotic factors and transcription factors C/EBP-α, C/EBP-β and PU.1 was measured by real-time PCR.

Plasma PR3, pro-PR3, and proportion of mPR3+neutrophils were elevated in AASV. mPR3 and CD177 were co-expressed on a... (More)
ANCA-Associated Systemic Vasculitis (AASV) is characterized by leukocytoclasis- dying neutrophils surrounding small blood vessels. Previous studies have shown increased plasma PR3 and increased proportion of neutrophils expressing plasma membrane-associated PR3 (mPR3+).

Neutrophils were isolated by polymorphprep and membrane expression was measured by FACS. Plasma PR3, pro-PR3 and cytokines were measured by ELISA. Neutrophil apoptosis was measured by FACS after 20h in vitro culture. Expression of pro/anti-apoptotic factors and transcription factors C/EBP-α, C/EBP-β and PU.1 was measured by real-time PCR.

Plasma PR3, pro-PR3, and proportion of mPR3+neutrophils were elevated in AASV. mPR3 and CD177 were co-expressed on a subset of neutrophils both in AASV and controls. mPR3 expression was not correlated directly to circulating PR3 or PR3 gene transcription, but was dependent on transcription of the CD177 gene. AASV neutrophils had a significantly lower rate of apoptosis than neutrophils from healthy blood donors (HBD). Lower apoptosis rate did not correlate with clinical data, plasma PR3, cytokine levels, mPR3 expression or level of pro/anti-apoptotic factors. However, C/EBP-α and C/EBP-β were significantly higher in neutrophils from AASV patients than in HBD neutrophils.

These results indicate an altered neutrophil phenotype in AASV and suggest that the rate of granulopoiesis is higher, while the rate of neutrophil apoptosis is lower. This may predispose for the presence of dying neutrophils in regions of inflammation in AASV. Additional studies are required to determine why the rate of neutrophil apoptosis is lower in AASV patients and if dysregulation of neutrophil apoptosis contributes directly to the pathogenesis. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Professor Kettritz, Ralph, Professor
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Wegener’s granulomatosis, anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA). Proteinase 3 (PR3), myeloperoxidase (MPO). Flowcytometry (FACS). Vasculitis., microscopic polyangitis
in
Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
volume
2010:95
pages
162 pages
publisher
Lund University
defense location
Föreläsningssalen, Alwall huset, Barngatan 2, Lunds Universitetssjukhus
defense date
2010-10-29 09:00
ISSN
1652-8220
ISBN
978-91-86671-11-2
language
English
LU publication?
yes
id
df1ca3fd-b33c-4462-a170-97eee9bad915 (old id 1689759)
date added to LUP
2010-10-06 08:03:42
date last changed
2018-05-29 12:02:19
@phdthesis{df1ca3fd-b33c-4462-a170-97eee9bad915,
  abstract     = {ANCA-Associated Systemic Vasculitis (AASV) is characterized by leukocytoclasis- dying neutrophils surrounding small blood vessels. Previous studies have shown increased plasma PR3 and increased proportion of neutrophils expressing plasma membrane-associated PR3 (mPR3+). <br/><br>
Neutrophils were isolated by polymorphprep and membrane expression was measured by FACS. Plasma PR3, pro-PR3 and cytokines were measured by ELISA. Neutrophil apoptosis was measured by FACS after 20h in vitro culture. Expression of pro/anti-apoptotic factors and transcription factors C/EBP-α, C/EBP-β and PU.1 was measured by real-time PCR. <br/><br>
Plasma PR3, pro-PR3, and proportion of mPR3+neutrophils were elevated in AASV. mPR3 and CD177 were co-expressed on a subset of neutrophils both in AASV and controls. mPR3 expression was not correlated directly to circulating PR3 or PR3 gene transcription, but was dependent on transcription of the CD177 gene. AASV neutrophils had a significantly lower rate of apoptosis than neutrophils from healthy blood donors (HBD). Lower apoptosis rate did not correlate with clinical data, plasma PR3, cytokine levels, mPR3 expression or level of pro/anti-apoptotic factors. However, C/EBP-α and C/EBP-β were significantly higher in neutrophils from AASV patients than in HBD neutrophils.<br/><br>
These results indicate an altered neutrophil phenotype in AASV and suggest that the rate of granulopoiesis is higher, while the rate of neutrophil apoptosis is lower. This may predispose for the presence of dying neutrophils in regions of inflammation in AASV. Additional studies are required to determine why the rate of neutrophil apoptosis is lower in AASV patients and if dysregulation of neutrophil apoptosis contributes directly to the pathogenesis.},
  author       = {AbdGawad, Mohamed},
  isbn         = {978-91-86671-11-2},
  issn         = {1652-8220},
  keyword      = {Wegener’s granulomatosis,anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA). Proteinase 3 (PR3),myeloperoxidase (MPO). Flowcytometry (FACS). Vasculitis.,microscopic polyangitis},
  language     = {eng},
  pages        = {162},
  publisher    = {Lund University},
  school       = {Lund University},
  series       = {Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series},
  title        = {Proteinase 3 and Neutrophil Apoptosis in ANCA-Associated Systemic Vasculitis},
  volume       = {2010:95},
  year         = {2010},
}