The telomere binding proteins in yeast and their role in telomere maintenance

Abstract

Telomeres are the end-structures of linear chromosome which are crucial for maintaining genome integrity. The telomeres prevent the DNA-repair machinery from recognizing the chromosome ends as double-strand breaks and from end-to-end fusions. The telomeres are composed by short repetitive units of TG-rich DNA and associated specialized telomere-binding proteins.



Due to that replication only can occur unidirectional the telomeres become shorter as cells proliferate. This functions as a “biological clock” for the cells which will senescence after a certain number of divisions because of the shortening of the telomeres. In stem cells, germ cells and unicellular organism with linear chromosomes this shortening is counteracted by a ribonucleoprotein enzyme called telomerase. Telomerase adds on repetitive DNA units to the outermost end of the telomere according to a template sequence within an intrinsic RNA-subunit of the enzyme. Telomerase prefers to extend short telomeres over long telomeres hence the enzyme is able to scrutinize between telomeres of different lengths. This ability is partly controlled by the telomere associated proteins which can make the telomere end more or less accessible for telomerase depending on the length of the telomere.



All known telomeres end with a single-stranded 3’overhang which server as a substrate for the telomerase enzyme as well as a binding site for the Cdc13 protein. The duplex telomeric DNA is bound by the Rap1 protein, which is a negative regulator of telomere length. My doctoral thesis focuses on understanding how the telomere binding proteins bind to DNA and how they interact with each other. I have determined the terminal nucleotide of the complementary AC-rich 5’strand, which will dictate the composition of the telomeric double-stranded- and single-stranded junction (ds-ss junction). In addition, I have in detail analyzed how the telomere-binding proteins Rap1 and Cdc13 bind to telomeric DNA and how they assemble around the ds-ss junction. Moreover I have also characterized the telomerase enzyme and its ability to prime and elongate different types of substrates. These findings have led to a better understanding of the molecular details that involve the intriguing absolute ends of chromosomes.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I de flesta organ i människokroppen pågår en ständig förnyelse av celler för att kompensera för gamla cellers bortfall som en följd av skador och naturlig död. En ensam cell kan på egen hand kopiera allt sitt DNA och därmed all information den bär på, för att därefter dela sig och skapa en exakt identisk kopia av sig själv. Kodat i DNA finns instruktionerna för hur en organism ska se ut, omsorgsfullt paketerat i kromosomer. Som en följd av hur det molekylära maskineriet som kopierar DNA ser ut, blir kromosomerna lite kortare för varje celldelning. Detta resulterar i att en cell inte kan dela sig oändligt många gånger eftersom essentiell information riskerar att gå förlorad. Som en säkerhetsåtgärd får därför cellen en signal när kromosomerna blivit kritiskt korta vilket leder till att den slutar dela sig och istället går in i en sovande fas eller självdör. Detta är en av anledningarna till varför vi alla åldras och slutligen dör. Vid celldelning är det de yttersta ändarna av kromosomen som blir kortare. I kromosomändarna finns finurligt nog en specifik struktur som består av repeterade DNA sekvenser som inte bär på någon genkodande information. Således hålls den viktiga informationen intakt medan celldelningarna ”tuggar” av den yttersta icke-informativa änden. Denna specifika änd-struktur på kromosomen kallas telomeren.

Telomererna består dels av de repeterande DNA-sekvenserna men också av olika proteiner som känner igen och binder till just dessa sekvenser. Proteinerna skyddar kromosomänden och hjälper cellen att skilja dessa ändar från en skadad kromosom. Cellen har nämligen ett mycket alert DNA-reparationssystem som ständigt söker brott på kromosomen att laga. De telomerbindande proteinerna hjälper alltså cellens reparationssystem att skilja dessa naturliga ändar från ändar som uppstått p.g.a. skador på DNA.

Speciella celltyper, såsom stamceller och könsceller har ett sätt att undgå denna förkortning av kromosomerna. Även encelliga organismer som jäst behöver kunna kringgå förkortningen. I dessa celltyper finns ett särskilt enzym aktiverat, kallat telomeras, som kan förlänga kromosomändarna, och därmed i princip ge dessa cellerna evigt liv. Upptäckten av detta viktiga enzym blev belönat med Nobelpriset i Medicin 2009. Telomeras har ett komplicerat och sofistikerat samarbete med de telomerbindande proteinerna för att säkerställa att rätt kromosom förlängs vid rätt tidpunkt till rätt längd. Det är lika viktigt att telomererna inte blir för långa som det är att de inte ska vara för korta. Extremt långa telomerer har nämligen satts i samband med många cancertyper.

I mitt doktorsarbete har jag studerat telomeraseenzymet och hur de telomerbindande proteinerna binder till de repeterande DNA-sekvenserna samt hur de samspelar med varandra. Jag har kunnat visa på tidigare helt okända egenskaper hos ett av de telomerbindande proteinerna som kallas Rap1. Generellt är DNA nästan alltid en dubbelsträngad molekyl, men i den allra yttersta kromosomänden övergår det dubbelsträngade DNAt till en enkelsträngad molekyl. Jag har kunnat visa att Rap1 har förmågan att binda till gränsen mellan det dubbelsträngade och det enkelsträngade DNAt. Hur Rap1 binder till DNA har betydelse för hur andra protein måste anpassa sig, vilket i sin tur kan påverka hur telomerasenzymet kan komma åt och förlänga telomeren.

Arbetet har även innefattat en detaljerad analys av hur Rap1 specifikt interagerar med DNA samt ett annat telomerbindande protein som kallas Cdc13. Cdc13 binder enbart till det enkelsträngade överhänget allra ytterst på telomeren. Jag har i detalj försökt kartlägga hur regionen runt det området där dubbelsträngat DNA övergår till enkelsträngat DNA är komponerad för att kunna utröna hur Rap och Cdc13 faktiskt interagerar med varandra och skyddar DNAt just här.

Även om det snart passerat 30 år sedan telomerasenzymet upptäcktes och intresset för telomererna väcktes på allvar, är många av de molekylära mekanismerna som rör området fortfarande okända. Vi vet t.ex. inte vad det är som styr exakt vilka telomerer som kommer att förlängas av telomeras inför en celldelning. Flera sjukdomar, däribland olika former av cancer, är dessutom starkt kopplade till regleringen av telomererna vilket är en av många anledningar till varför det är viktigt för oss att förstå hur allt hänger samman på molekylär nivå.

• author: Gustafsson, Cecilia
• supervisor: Marita Cohn
• opponent: Professor Shore, David, Department of Molecular Biology, University of Genève, Genève, Switzerland
• organization: Molecular Cell Biology; Department of Biology
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• pages: 150 pages
• defense location: Lecture Hall, Biology Building A
• defense date: 2013-02-19 09:30:00
• ISBN: 978-91-7473-445-4
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 2e8948fb-96ed-4918-a22a-3856a40dc782 (old id 3404926)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:55:18
• date last changed: 2018-11-21 21:01:35