Water and protein solutions studied by field-dependent magnetic relaxation

Abstract

In the work presented, nuclear magnetic resonance (NMR) relaxation is used to study wide range of systems. The thesis concerns solvent interactions studied with relaxation techniques that involve measurements at many fields, which allows the separation of individual relaxation mechanisms. The approach also makes it possible to characterize the involved dynamic properties in much greater detail.



The structure of liquid water is studied by investigating a hitherto unexploited relaxation mechanism for water protons, induced by the anisotropy of the chemical shielding tensor. By comparing the experimental results to theoretical calculations on the relation between water structure and the shielding tensor, it was possible to determine the hydrogen bond geometry over nearly the full temperature range of liquid water.



The magnetic relaxation dispersion (MRD) technique carries the unique potential to directly monitor the solvent interactions with macromolecules. Here, the MRD of water was used to investigate the hydration of the large cavity found in the intra-cellular lipid-binding proteins. The about 20 water molecules within the cavity were found to exchange positions on the nanosecond time-scale, while exchanging with bulk water at least an order of magnitude slower. Upon ligand binding, the proteins expand their cavity volumes.



Focusing on the solvent, MRD is very useful in studies of protein stability. Thus, equilibrium urea denaturation of intestinal fatty acid-binding protein (I-FABP) was followed by the MRD of both water and the denaturing agent. At least one water molecule binds to the protein in the presence of 7.5 M urea, where I-FABP appears denatured by conventional methods. The MRD data also suggest that the denatured state is much more compact than a fully solvated polypeptide.



Similarly, the beta to alpha transition of beta-lactoglobulin (BLG) induced by trifluoroethanol (TFE) was investigated by the MRD of both water and TFE. The data indicate a preferential binding of TFE to the protein surface and demonstrate that BLG binds several long-lived (5-10 ns) TFE molecules in both states. During the transition, the protein expands and the TFE induced state consists of alpha-helical segments. Our data encourage the speculation that these segments are loosely tied together by TFE molecules (via dispersion forces) and water (via hydrogen bonds).



Finally, the MRD method is compared to the use of intermolecular NOEs (nuclear Overhauser effect) between water and protein protons in studies of protein hydration. To focus on the surface hydration, we obtained the water MRD in deeply supercooled solutions of the peptide oxytocin and the globular protein BPTI. A large majority of the surface waters are dynamically retarded by only a factor of 2 as compared to bulk water. The NOE method frequently yields a retardation that is at least an order of magnitude longer. This inconsistency is removed by invoking a new model for the interpretation of NOE data, which shows that the NOEs of surface protein protons to water are dominated by long-range dipolar couplings.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Kärnmagnetisk resonans (NMR) är en metod som bygger på att många atomkärnor uppför sig som mycket små magneter. Detta i sin tur beror på att kärnan beter sig som en liten roterande laddning. Man säger att kärnan har ett <i>spinn</i>, eller att kärnan <i>är</i> ett spinn.



I min avhandling använder jag mig av en fantastisk egenskap hos kärnspinnen. Om man stör systemet kommer det att vilja <i>relaxera</i> tillbaks till utgångsläget som vi kallar <i>jämvikt</i>. Hastigheten med vilken systemet relaxerar beror på vilka interaktioner kärnspinnen känner och hur de varierar i tiden. I en vätska pågår ständig rörelse. Det som gör NMR kraftfullt är att det finns (relativt) enkla metoder att beskriva hur rörelserna påverkar relaxationen. Genom att mäta relaxationen kan man därför säga något om hur och hur snabbt molekylerna rör sig!



Proteiner är mycket stora molekyler som är av oerhört stor betydelse eftersom allt levande består av dem. De bygger upp människokroppen, men är också naturens verktyg. Eftersom proteiner är stora och består av många slags mindre byggstenar (aminosyror) är de också mycket svåra att förstå sig på och vi är långt ifrån att tillförlitligt kunna räkna oss fram till funktionen och strukturen av ett okänt protein. Alla proteiner i kroppen befinner sig i en omgivning av något slag. Ofta är omgivningen vatten, men ett protein kan även omge sig av andra proteiner eller cellmembran. Omgivningen har stor betydelse för hur proteinet fungerar, men också varför det ser ut som det gör. Jag har studerat hur omgivningen växelverkar med olika protein. En studie undersöker hur vattnet växelverkar med en typ av protein som binder fettsyror. Proteinet bildar ett stort hålrum där det finns vattenmolekyler, men hålrummet binder även fettsyran. I den metod jag använder studerar man proteinets interaktioner med vattenmolekylerna i hålrummet med hjälp av vattnets kärnspinnrelaxation. Resultaten visar att vattenmolekylerna byter plats med varandra inne i hålrummet på ca en miljarddel av en sekund, vilket är långsamt (!) om man jämför med hur snabbt liknande processer sker i rent vatten. Vattnet i hålrummet byter sedan med vattnet runt proteinet efter mer än 10 miljarddelar av en sekund men kortare än en miljondel av en sekund.



Två studier handlar om hur andra lösningsmedel än vatten påverkar proteiner. Jag har valt att studera urea och ett etanolderivat. Varför vill man göra något sådant? Orsaken är ganska enkel. Urea och alkoholer har länge använts som verktyg i studier av proteiners stabilitet. Ett protein består egentligen av en lång kedja aminosyror som på något sätt finner en tredimensionell struktur. De stora obesvarade frågorna inom proteinkemin är hur proteinerna finner denna struktur (proteinveckningsproblemet) och varför den sedan är stabil. Andra lösningsmedel än vatten har ofta egenskapen att de förstör proteinets tredimensionella veckning, dvs de gör proteinet instabilt. Man säger att proteinet <i>denaturerar</i>, dvs vecklar ut sig. Genom att systematiskt förändra proteinet genom mutationer och sedan denaturera med t. ex. urea kan man därför undersöka vilken betydelse olika krafter har för proteiners stabilitet. Men, för att dra några slutsatser av detta måste vi förstå <i>hur</i> lösningsmedlen destabiliserar strukturen. Mina studier visar att både urea och alkohol växelverkar direkt med proteinet, medan de påverkar proteinets interaktioner med vatten på olika sätt. Dessutom verifierar ureastudien att den denaturerade formen också är ganska kompakt. Detta är något man inte trodde för några år sedan, men som nu finner allt mer experimentellt stöd.



Ytterligare en studie rör vattemolekylerna nära ytan av ett protein. Det är viktigt att förstå hur dessa beter sig eftersom de kan förväntas ha stor betydelse för proteinets stabilitet och dess växelverkan med andra biomolekyler. Tidigare trodde man att ytvattnet binder länge till ytan pga starka vätebindningar, men den uppfattningen har fått stryka på foten under årens lopp. Vi tror snarare att de flesta vattnen på ytan har nästan lika snabb dynamik som vattenmolekylerna i rent vatten, dvs de snurrar ett varv på ca 20-200 miljondelar av en miljondels sekund. Studien gjordes på ett lite spektakulärt sätt. Vi stoppade in proteinerna i emulsioner som går att underkyla till lägre temperaturerer än -30 °C. (Rent vatten fryser vid 0 °C endast om det finns föroreningar eller liknande i vattnet som iskristallerna kan utgå från.) På detta sätt hoppades vi kunna får processerna vid ytan att gå så långsamt att vi kunde studera dem mer noggrant. Det visar sig att vattnet på ytan går att dela in i två klasser. De flesta snurrar mycket snabbt, medan några få (cirka 5 för ett litet protein) rör sig långsammare eftersom de befinner sig i "fickor" på proteinet.



Vatten är på många sätt en märklig vätska som vi inte till fullo begriper. Som ett exempel kan nämnas att trots att molekylerna i flytande vatten är i genomsnitt nästan lika mycket vätebunda till varandra som i is, är dynamiken oerhört mycket snabbare. Ett problem är att det finns få sätt att experimentellt studera vätebindingen mellan två närliggande vatten eftersom de klassiska metoderna inte på ett enkelt sätt kan se skillnad på den vattenmolekyl som är inblandad i vätebindingen och de som inte är det. Jag har använt NMR-relaxation just för att försöka göra detta. Genom att kombinera experiment och teori har jag kunnat bestämma både vinkeln och avståndet i vätebindingen som funktion av temperaturen. Resultaten visar, precis som man kanske kan förvänta sig, att vätebindingen blir mer och mer förvrängd ju närmare kokpunkten man kommer, dvs både avståndet och vinkeln blir större i genomsnitt. Vid kokpunkten bryts bindingarna helt och vattnet förångas. Metoden skulle kunna användas för att studera andra system där det är svårare att veta vad man förväntar sig, men mina resultat kan också användas för att förbättra de teoretiska modeller som finns för vatten.

• author: Modig, Kristofer
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Brüschweiler, Rafael, Carlson School of Chemistry and Biochemistry, 950 Main Street, Worcester, MA 01610, U.S.A.
• organization: Biophysical Chemistry
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Physical Chemistry
• keywords: relaxation, protein solvation, protein dynamics, protein denaturation, oxytocin, magnetic relaxation dispersion, nuclear magnetic resonance, lipid-binding protein, hydration, beta-lactoglobulin, BPTI, shielding anisotropy, water, Molecular biophysics, Molekylär biofysik
• pages: 248 pages
• defense location: Lecture hall B at Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund Institute of Technology.
• defense date: 2003-09-12 13:15:00
• ISBN: 91-7422-028-4
• language: Swedish
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Proton magnetic shielding tensor in liquid water.Kristofer Modig and Bertil Halle.Journal of the American Chemical Society 124, 12031-12041 (2002). Article: Temperature-dependent hydrogen-bond geometry in liquid water.Kristofer Modig, Bernd G. Pfrommer and Bertil Halle.Physical Review Letters 90, 075502 (2003). Article: Water dynamics in the large cavity of three lipid-binding proteins monitored by 17-O magnetic relaxation dispersion.Kristofer Modig, Martin Rademacher, Christian Lücke and Bertil Halle.Journal of Molecular Biology. Accepted for publication. Article: Water and urea interactions with the native and unfolded forms of a ß-barrel protein.Kristofer Modig, Elizabeth Kurian, Franklyn G. Prendergast and Bertil Halle.Submitted to Protein Science. Article: The beta to alpha transition in ß-lactoglobulin as seen from the solvent.Sandeep Kumar, Kristofer Modig and Bertil Halle.Submitted to Biochemistry. Article: Dynamics of protein and peptide hydration.Kristofer Modig, Edvard Liepinsh, Gottfried Otting and Bertil Halle.To be submitted.
• id: 3023bb7f-7e1b-446a-9af2-f07b1c160c41 (old id 466086)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:01:22
• date last changed: 2020-11-13 02:24:28