Regulation of Islet Function by the Neuropeptide PACAP

Abstract

It is known that parasympathetic, sympathetic and sensory nerves innervate the islets and that these nerves harbor both classical neurotransmitters and neuropeptides. However, the neural influence on islet hormone release is complex and not yet fully understood A recently discovered pancreatic neuropeptide is pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP). The aim of this thesis was to establish the role of PACAP in the regulation of islet function by using a variety of cell biological techniques in isolated islets and insulin producing clonal cells, in combination with in vivo studies in mice and humans.



PACAP was localized to pancreatic nerves within the islets, and two of the three established PACAP receptors were expressed in islet cells. PACAP stimulated insulin secretion from isolated mouse and rat islets, as well as in the insulin producing clonal cell lines HIT-T15 and RINm5F. This action was accompanied by formation of cAMP and increases in cytoplasmic Ca2+ and Na+ and dependent on the extracellular concentrations of glucose, Ca2+ and Na+. Furthermore, addition of specific PACAP antisera to isolated rat islets inhibited glucose-induced insulin secretion. In anesthetized mice, injection of glucose together with PACAP27 increased plasma insulin levels, without affecting plasma glucose levels compared to controls injected with glucose alone. Plasma glucagon and plasma adrenaline levels were increased by injection of PACAP. By analyzing the data according to the minimal model technique, PACAP reduced insulin sensitivity without altering glucose effectiveness. Injection of a specific PACAP receptor antagonist in anesthetized mice prior to presentation of a gastric glucose gavage reduced plasma insulin levels compared to controls given saline. Finally, infusion of PACAP27 in humans increased circulating insulin and glucagon levels, without altering glucose elimination rate.



These results shows that PACAP is exclusively a neuropeptide in the islets, that the insulinotropic action of PACAP is mediated by activation of adenylate cyclase in combination with cytoplasmic changes in Ca2+ and Na+, and that PACAP contributes to glucose- and meal-induced insulin secretion. This suggests that PACAP is a neuropeptide in the endocrine pancreas of physiological importance for the regulation of islet function.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Omkring 2% av världens befolkning lider i dag av folksjukdomen diabetes och siffran ökar ständigt. Trots behandling får många diabetespatienter komplikationer av sin sjukdom, såsom fotsår, nedsatt syn, känselbortfall, njursvikt, kärlkramp och hjärtinfarkt. Halten av insulin i blodet spelar en viktig roll vid uppkomsten av diabetes. Insulinet produceras i bukspottkörteln, som finns bakom magsäcken.



Bukspottkörteln, pankreas, består av två delar: en exokrin och en endokrin del. I den exokrina delen produceras den enzymrika pankreassaften, som utsöndras till tunntarmen efter födointag. Enzymerna aktiveras och maten bryts ned i små beståndsdelar som sedan kan tas upp genom tarmväggen. Den endokrina delen av bukspottkörteln består av de s.k. Langerhanska öarna. Dessa cellöar ligger utspridda i den exokrina delen och utgör ca 1-2% av bukspottkörtelns totala vikt. Den största, centralt liggande delen av öarna utgörs av de s.k. beta-cellerna. I dessa produceras insulin, vars uppgift är att möjliggöra för cellerna i kroppen att ta upp och utnyttja sockret i blodet. Utan tillräckligt med insulin kan cellerna inte ta upp glukos, och då får de inte näring. En person som saknar insulin får diabetes.



En annan typ av endokrina celler i bukspottkörteln är alfa-cellerna. Dessa producerar hormonet glukagon, som man kan säga är insulinets motpart. Glukagon höjer blodsockernivån framförallt genom att stimulera glukosproduktionen från levern. Utsöndringen av insulin och glukagon regleras till stor del av blodsockernivån, men även andra faktorer såsom hormoner och det autonoma, dvs icke viljestyrda, nervsystemet (ANS) spelar roll. Öarna har fler nerver än kringliggande vävnad, vilket antyder att nervsystemet är viktigt för att reglera öarnas funktion. Vår forskargrupp har inriktat sig på att kartlägga hur nerver och hormoner påverkar insulinutsöndringen. Syftet är att vi bättre ska förstå hur diabetes uppkommer.



Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP) är en signalsubstans i ANS som har påvisats i nerver i bukspottkörteln. Målet med min avhandling var att undersöka vilken roll PACAP spelar i regleringen av öarnas funktion.



Artikel I: I den första studien har vi undersökt om PACAP och receptorer (mottagare) för PACAP finns i bukspottkörteln, och om PACAP har någon effekt på insulinutsöndringen. Receptorer finns på alla cellers ytor och är specifika för olika hormon och signalsubstanser. Hormonet eller signalsubstansen bildar med "sin" receptor ett komplex som aktiverar cellen. Vi ville vi alltså undersöka om receptorer för PACAP fanns på celler i bukspottkörteln. Vi använde dels pankreas från råtta och mus, dels insulinproducerande tumörceller från hamster respektive råtta. Vi visar här att PACAP finns i nerver i pankreas men inte i några andra pankreasceller. Dessa nerver finns både i den exokrina delen av bukspottkörteln och i de Langerhanska öarna men också runt blodkärlen i körteln. Vidare visar vi att två av de tre hittills upptäckta receptorerna för PACAP finns i öarna, och att PACAP stimulerar insulinutsöndringen både i öar som man tagit ut ur pankreas och i insulinproducerande tumörceller.



Artikel II och III: Målet var att undersöka hur PACAP signalerar till beta-cellen att frisätta insulin. Man vet att det finns olika sk signalvägar inne i cellen, som alla leder till att insulin frisätts. Dessa signalvägar aktiveras av olika receptorer, och medför att koncentrationen av speciella budbärarmolekyler höjs eller sänks i cellen. Vi jämförde koncentrationen av två sådana budbärarmolekyler efter tillförsel av PACAP och visade att innehållet av cykliskt AMP (cAMP) höjs av PACAP medan innehållet av inositolfosfater inte påverkas. Även jon-koncentrationerna i cellen spelar stor roll för utsöndringen av insulin. Vi visade att kalciumnivån i cellen höjs av PACAP. Kalcium är en viktig jon i dessa sammanhang, och dess koncentration i cellerna är strikt reglerad. En annan viktig jon är natrium, och i artikel III visade vi att även nivån av natrium höjs i cellen om man tillför PACAP. Sammanfattningsvis kan man säga att när PACAP fastnar på sin receptor på cellytan startar en kaskad av händelser som bl.a. medför att cAMP liksom natrium- och kalciumnivåerna i cellen höjs. Allt detta bidrar sedan till att insulin frisätts från cellen.



Artikel IV: Målet var att undersöka om PACAP har effekt på insulinutsöndringen också på människa. Sju friska kvinnor ställde frivilligt upp på att vara med i studien. De var alla 57 år gamla och ingen av dem tog någon medicin som kunde påverka studien. Vi gav PACAP i blodet i konstant hastighet under 75 minuter. Efter 15 minuter gav vi en injektion med glukos för att höja blodsockret och undersöka effekten av PACAP också under dessa förhållanden. Under kontrollförsöken gav vi kvinnorna saltlösning istället för PACAP. Vi visade att PACAP stimulerade både insulin- och glukagonsekretionen efter glukosinjektionen, och resultatet blev att den uppmätta blodsockerhalten var högre när vi hade gett PACAP än i kontrollförsöken, dvs motsatt effekt än vad man vill att ett läkemedel mot diabetes ska ha. Att sänka blodsockret är ju den viktiga uppgiften för alla diabetesmediciner. Det höjda blodsockret talar för att PACAP påverkar glukagonutsöndringen mer än insulinsekretionen eftersom den ökade koncentrationen av insulin i blodet annars skulle sänkt blodsockret. Glukagon motverkar denna effekt av insulin.



Artikel V: Denna studie kan jämföras med studien på kvinnorna, men genom att använda försöksdjur (möss) kan vi lättare undersöka vilka mekanismer som förmedlar effekten av PACAP på insulin- och glukosnivån i blodet. Vi visade här att PACAP stimulerar insulin- och glukagonsekretionen, men att blodglukosvärdet inte ändras trots insulinstegringen. Genom att analysera insulin- och glukagonvärdena med en avancerad matematisk modell fann vi att PACAP hämmar insulinkänsligheten i vävnader såsom muskler och fettväv. Därmed reagerar vävnaderna inte lika bra på en ökning av insulin i blodet, och följden blir att glukosnivån i blodet inte sjunker. Eftersom PACAP i tidigare studier har visats stimulera frisättning av adrenalin från binjurarna mätte vi i denna studie adrenalinhalten i blodet med och utan stimulering med PACAP. Resultatet visade att PACAP ökade adrenalinnivån, vilket tyder på att PACAP stimulerar adrenalinsekretionen från binjurarna även hos möss. Det är känt att adrenalin hämmar insulinkänsligheten, varför vi drog slutsatsen att PACAPs förmåga att minska insulinkänsligheten till största delen förmedlas av adrenalin.



Artikel VI: Målet med denna studie var att undersöka effekten av PACAP under lite mer normala förhållanden än i artikel IV och V. Att spruta in PACAP i en hög dos i blodet är en mycket grov metod att få reda på något om PACAPs roll i kroppen, eftersom detta inte liknar något tillstånd kroppen normalt utsätts för. I denna studie utfördes experimentet på isolerade öar från råtta, och vi använde antikroppar mot PACAP. Antikropparna binder upp PACAP så att PACAP-receptorerna inte längre känner igen PACAP, och då aktiveras inte cellerna. Genom att tillsätta antikroppar men inte PACAP binder man också upp det PACAP som redan finns i öarna och kan då se hur insulinsekretionen fungerar utan PACAP. Vi fann att tillförsel av PACAP-antikroppar hämmade insulinsekretionen efter stimulering med glukos, vilket talar för att PACAP normalt finns i öarna och bidrar till den glukosstimulerade insulinsekretionen. Om man före försöket odlade öarna i 48 timmar efter isolering kvarstod inte denna hämning. Detta talar för att det PACAP som stimulerar insulinsekretionen kommer från nerverna, eftersom nerverna förstörs om man odlar öarna i 48 timmar efter isolering.



Artikel VII: I denna studie vill vi undersöka en annan aspekt av PACAPs normala roll. Andra forskare har tidigare visat att insulin i blodet ökar mer om man äter en sockerbit än om man höjer blodsockret genom att spruta samma mängd socker i blodet. Detta anses bero på att en måltid påverkar många fler system som deltar i regleringen av insulinfrisättningen, bl.a. hormon och ANS. Eftersom PACAP finns i ANS i bukspottkörteln, ville vi studera om PACAP deltar i denna nervförmedlade höjning av insulin i blodet efter måltid. Vi gjorde detta genom att använda en s.k. PACAP-antagonist som fastnar på PACAP-receptorerna och blockerar dem utan att aktivera dem. Då kan inte PACAP komma åt sina receptorer, och kan alltså inte medverka i höjningen av insulinsekretionen. Vi sprutade in PACAP-antagonisten i blodet på sövda möss och gav sedan mössen socker att äta via en sond som var nerlagd i magen. Därefter tog vi blodprover och mätte insulin och glukos. Insulinnivåerna i blodet var lägre när vi förberett djuren med PACAP-antagonisten än när vi inte hade gjort det. Dessa resultat talar för att PACAP tillsammans med andra hormon och signalsubstanser är viktigt för att få en adekvat insulinfrisättning efter måltid. Utan denna insulinfrisättning blir blodsockret för högt, som vid diabetes.



Sammanfattning: Vi kan konstatera att PACAP finns i nerver i de Langerhanska öarna, och att PACAP stimulerar insulinsekretionen i flera olika system. Vi vet också att PACAP spelar stor roll vid regleringen av öarnas funktion, och att man utan PACAP får en försämrad tidig insulinfrisättning efter måltid, vilket är utmärkande för diabetes. Eftersom PACAP kraftfullt stimulerar insulinsekretionen, skulle PACAP i framtiden kunna användas i diabetesbehandlingen. Detta kräver dock att PACAP-molekylen modifieras så att den specifikt stimulerar insulinsekretionen utan att också påverka de faktorer som dels hämmar insulinsekretionen, dels motverkar insulinets effekt.

• author: Filipsson, Karin
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Smith, David, Endocrine Unit, Hammersmith hospital, London, UK.
• organization: Diabetes - Molecular Metabolism (research group)
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Clinical Medicine
• keywords: postprandial, calcium, sodium, cAMP, intracellular signaling, glucagon, insulin, Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP receptors, Endocrinology, secreting systems, diabetology, Endokrinologi, sekretion, diabetologi
• pages: 176 pages
• defense location: Medicinskt Forskningscentrum, Malmö, Sweden
• defense date: 1999-12-10 09:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEMM-1052-SE
• ISBN: 91-628-3920-9
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 4c636f7a-2ff4-4ecc-8888-2fb1200ff30d (old id 40042)
• date added to LUP: 2016-04-04 13:20:00
• date last changed: 2018-11-21 21:13:18