Aspects of autoantibody epitopes in type 1 diabetes

Abstract

Type 1 diabetes (T1D) is strongly associated with autoantibodies against insulin (IAA), glutamic acid decarboxylase 65 (GADA), insulinoma-associated protein 2 (IA-2A) and the most recently identified zinc T8 transporter (ZnT8A). Together or alone, they are important both to predict T1D and to classify diabetes at the time of clinical onset. The single nucleotide polymorphism (SNP) rs13266634 in the SLC30A8 gene encodes either an arginine (R) or a tryptophan (W) (R325W) at the amino acid (aa) position 325 in the ZnT8 protein. Autoantibodies that recognize ZnT8-arginine (ZnT8RA), ZnT8-tryptophan (ZnT8WA), or both, but restricted by the polymorphic site of the ZnT8 protein are common in newly diagnosed T1D patients. However, the epitope specificity and affinity of ZnT8A are poorly understood. The autoantigenicity of the ZnT8 polymorphism is unique and comparable protein sequence variations are not found for insulin, GAD65 or IA-2.

Neuropeptide Y (NPY) was reported as a minor autoantigen in T1D. This neurotransmitter has a SNP, rs16139, at aa position 7 in the NPY gene. The major allele is coding for leucine (L), and the minor for proline (P). The latter has been associated with impaired glucose tolerance and increased risk for type 2 diabetes (T2D). However, the possible autoantigenicity of the NPY polymorphism in T1D has not been investigated.

The overall aim of this thesis was to investigate the autoantibody epitopes of ZnT8 and NPY in newly diagnosed T1D patients as well as in patients with long-term T1D and T2D.

Our data in paper I and IV suggests that the polymorphic 325 variant is a major determinant of a conformation-dependent ZnT8A epitope. However, human sera with ZnT8-specific autoantibodies against either the R or the W variant did not recognize ZnT8 (318-331) peptides. It was therefore suggested that the conformational epitope recognized by the autoantibodies requires yet other amino acids beyond the 318-331 peptide of ZnT8. In addition, T1D patients with specific ZnT8WA displayed higher affinity compared to patients with specific ZnT8RA as demonstrated in reciprocal competitive displacement experiments. We suggest that future studies should include the ZnT8A variant specificity in both humoral and cellular tests to understand the possible role of autoantibody affinity to predict T1D.

In order to investigate the presence of NPY autoantibody (NPYA) variants (L or P at aa position 7), we developed radiobinding assays for both variants. We identified NPY-LA (23%) and NPY-PA (19%) in long-term T1D and 12% and 23% in T2D patients, respectively. The frequency of NPYA in newly diagnosed T1D patients at 1-18 years of age was 17% for NPY-LA and 24% for NPY-PA. In statistical regression analyses adjusted for gender, HLA and autoantibody status, NPYA were more common in children with older age at onset compared to children at younger age at onset. We suggest that NPYA may prove useful in the screening of young adults and in patients with long-term diabetes. The autoantibody response against the L7P polymorphic site was rarely specific to any of the two amino acid variants.

This thesis has revealed novel insights of the ZnT8A affinity to the 325-epitope and the possible importance of autoantibody affinity in T1D. Novel insights also include NPY as a minor autoantigen of significance to diabetes etiology and pathogenesis. Therefore, both epitope-specific ZnT8 and NPY autoantibodies are suggested to be included in future attempts to identify islet autoimmunity and to predict the clinical onset of autoimmune T1D.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I Sverige insjuknar två barn i autoimmun diabetes (typ 1 diabetes) varje dag. Typ 1 diabetes (T1D) är en kronisk autoimmun sjukdom som kan få livshotande konsekvenser vid utebliven behandling. Sverige har den högsta incidensen av T1D i hela världen efter Finland. Förutom att den delvis är ärftlig vet man inte vilken eller vilka faktorer som triggar sjukdomen. Sedan mitten av 1920-talet finns behandling i form av insulin, vilken måste injiceras i kroppen i samband med varje måltid under hela livet. Är inte sjukdomen under ständig kontroll kan ett barn få allvarliga komplikationer som hjärnödem och i värsta fall hamna i koma. Insulin är en livsnödvändighet, som inte finns att tillgå i alla delar av världen.



Attackerande immunförsvar bryter ned bukspottkörteln

T1D uppkommer för att immunsystemet, som vanligen skyddar oss genom att bekämpa bakterier och virus, istället attackerar frisk vävnad. En av anledningarna till att det händer är att toleransen mot kroppsegen vävnad bryts. Ett exempel är när immunsystemet dödar de insulinproducerande (β celler) cellerna i bukspottskörteln. Bukspottkörteln är ett viktigt organ eftersom det är källan till insulinproduktion och dess reglering. Insulin är ett hormon som utsöndras i respons av en måltid varpå insulinet kan liknas vid en nyckel som låser upp porten till vår vävnad. Utan nyckeln hålls porten stängd och näring från måltiden kan inte passera in i vävnaden. Kroppen kan således inte tillgodogöra sig näringen.



Autoantikroppar är viktiga markörer

Det är sedan länge känt att symptom av T1D först uppkommer när ungefär 80-90% av bukspottkörteln är nedbruten och inte längre kan producera tillräckligt med insulin. Nedbrytningen av bukspottkörteln kan starta redan vid 9 månaders ålder eller så sent som efter tonåren. Tiden från att nedbrytningen har startat till insjuknande kan dock variera från veckor till flera år hos personer med risk för att utveckla T1D. Denna obestämda tid representeras av autoantikroppar som är riktade mot särskilda proteiner i bukspottkörteln. Dessa specifika autoantikroppar finns i blodet hos ett barn som kommer att insjukna och kan med hjälp av laboratoriska metoder detekteras. Autoantikroppar fungerar därför som en markör både innan insjuknande (under tiden vid nedbrytning) och vid insjuknande då diagnos fastställs. Det medför att vi idag bättre kan förutspå ett barns utveckling av sjukdomen. Autoantikropparnas roll och varför de finns i blodet är dock ännu okänd.

Det främsta målet med dagens forskning är att förhindra sjukdomsutvecklingen av T1D och därmed kunna rädda bukspottkörteln innan insulinkällan har sinat. I denna avhandling har en del (studie I och IV) fokuserats på att studera autoantikropparna mot Zink transportör 8 (ZnT8A) och den andra delen (studie II och III) på att identifiera en ny autoantikropp riktad mot Neuropeptid Y (NPYA).



Zink transportör 8 (ZnT8) – proteinet med högst specificitet

Under 2007 visade en forskargrupp från USA att ett särskilt protein, ZnT8, i bukspottkörteln agerar måltavla för immunförsvarets attack. ZnT8-proteinets uppgift är att transportera zink in i insulin-vesiklarna i cellerna, vilket i möss har visats vara ytterst nödvändigt för insulinproduktion. Upp till 80 % av de barn som drabbas av T1D har ZnT8A i blodet, men när och hur denna markör uppstår är inte känt. Tre autoantikropps-varianter, mot ZnT8 har hittills upptäckts arginin (R), tryptofan (W) och glutamin (Q). Man kan ha en, två eller alla tre varianter. Vad som orsakar att man får en eller flera är inte klarlagt. Samtliga autoantikropps-varianter har tidigare visats binda till en särskild del (epitop) av ZnT8-proteinet. Denna epitop styrs av en genförändring (polymorfi), som bestämmer vilken variant av R, W eller Q i genomet som man har. ZnT8 autoantikropparna har förmågan att urskilja de olika varianterna i genomet och studier har visat att har man R i genomet så har man oftare R autoantikroppar. Det betyder att de tre varianterna av autoantikropparna kan se skillnad på endast en aminosyra (R, W eller Q) och har därmed extremt hög specificitet. Trots att detta är känt har den exakta epitopen ännu inte identifierats. Syftet i studie I och IV var därför att närmre studera hur ZnT8 autoantikroppar binder till epitopen av ZnT8-proteinet samt mäta autoantikroppsbindingen till epitopen.



Neuropeptid Y – ny måltavla för immunförsvaret?

Neuropeptid Y (NPY) är en neurotransmittor som mestadels uttrycks i det centrala nervsystemet, men även i det perifera nervsystemet som innerverar bukspottkörteln. NPY uttrycks tillsammans med insulin i insulin-vesiklar och har till uppgift att bland annat stimulera aptit. Ett flertal studier har identifierat att en särskild polymorfi i NPY-genen var vanligare hos överviktiga och typ 2 diabetes (T2D) patienter. Denna polymorfi medför att man istället för aminosyran Leucin (L) har Prolin (P) på en position i NPY-proteinet. Utöver NPYs roll inom T2D har NPY associerats med T1D. Under 2008 rapporterade en studie att ungefär 9% av nyligen insjuknade typ 1 diabetespatienter hade autoantikroppar mot NPY. Därför var syftet i studie II att utveckla en ny metod för att identifiera NPY autoantikroppar. I studien undersöktes NPY autoantikropparna i patienter som hade haft typ 1 eller typ 2 diabetes under 10-40 år. I studie III studerades NPY autoantikroppar hos patienter som nyligen insjuknat i T1D. Vi ville även studera likheter och skillnader mellan NPY autoantikropparna och de tidigare identifierade autoantikropparna vilka bland annat innefattade de tre ZnT8 autoantikropps- varianterna.



ZnT8 autoantikropparna skiljer sig i affinitet

I samarbete med ett företag och en annan forskargrupp i Lund producerade vi olika långa delar (peptid och protein) av ZnT8-proteinet. Alla dessa olika proteindelar omfattade den antagna epitopen till vilken ZnT8 autoantikropparna binder. För att identifiera den exakta epitopen samt hur autoantikropparna binder till epitopen utvecklade vi en ny laborativ metod. Metoden tillät oss att studera ZnT8 autoantikropparna i blodet hos nyligen insjuknade typ 1 diabetespatienter. I studie I och IV, rapporterade vi att epitopen av ZnT8 omfattade en större del än vad som tidigare uppskattats. Epitopen omfattade mer än 15 aminosyror och sträcker sig troligen utöver aminosyra position 318 till 331 av ZnT8-proteinet. Vi kunde även bekräfta att ZnT8 autoantikropparna är konformationsberoende. Det betyder att ZnT8-proteinet har en särskild struktur som känns igen av autoantikropparna. Vidare fann vi att ZnT8W autoantikropps-varianten hade starkare bindning (högre affinitet) till ZnT8-proteinet i jämförelse med ZnT8R autoantikropps-varianten hos patienter med T1D.



NPY autoantikroppar finns i blodet hos patienter med typ 1 diabetes

I studie II utvecklades två laborativa antikropps-metoder som skulle kunna identifiera två varianter av NPY autoantikroppar, Leucin (L) och Prolin (P). Metoderna verifierades i labbet och ansågs ha en hög precision. Vi fann att patienter som haft typ 1 eller typ 2 diabetes i upp till 40 år hade NPY autoantikroppar i blodet. NPY autoantikropparna kunde identifieras hos 29% av T1D patienterna i jämförelse med 13% av T2D patienterna. 15% av patienterna med T1D hade båda varianterna av autoantikroppar, NPY-L och NPY-P.

Utöver våra fynd i studie II identifierade vi att 26% av nyligen insjuknade T1D patienter hade NPY autoantikroppar (studie III). NPY autoantikropparna var vanligare bland barn som var äldre än 10 år vid diagnostillfället i jämförelse med barn som var yngre än 10 år. NPY autoantikropparna visade sig även förekomma oftare bland flickor än hos pojkar. Genom att analysera T1D patienter för NPY autoantikroppar kunde ca 1% av de tidigare autoantikropps-negativa patienterna betraktas som autoantikropps-positiva. Således bidrog NPY autoantikroppen till en förbättrad diagnostisk känslighet, vilket betyder att NPY autoantikroppen som ensam markör skulle kunna identifiera barn som riskerar att utveckla T1D.



Slutsats och framtidsperspektiv

Sammanfattningsvis så har vi utvecklat två nya metoder. Dessa har tillåtit oss att studera ZnT8 autoantikroppars affinitet samt att identifiera en ny autoantikropp riktad mot neurotransmittorn, NPY, hos patienter med T1D. Vi fann att affiniteten skiljer sig beroende på vilken variant av ZnT8 autoantikropp T1D patienter hade. Det har spekulerats om att affiniteten av autoantikroppar kan vara viktig eftersom den kan ha betydelse vid utvecklingen av T1D. Vi anser därför att fler affinitets-studier av autoantikroppar bör genomföras för att se huruvida affinitet kan bidra till att förutspå att ett barn kommer att insjukna i T1D. Vi har även visat att NPY autoantikroppar både finns hos patienter med lång duration och bland dem som nyligen har insjuknat i T1D. Vi påvisade även NPY autoantikroppar hos patienter som inte hade någon av de andra autoantikropparna. Vi föreslår att analys av NPY autoantikroppar bör göras som ett komplement till redan etablerad autoantikropps-analys. Detta skulle kunna gynna personer som vid diagnostillfället inte har identifierats med andra autoantikroppar, eller som har en ökad risk att insjukna. Kostnaden av NPY autoantikropps-analysen bör dock vägas mot nyttan av att identifiera autoantikropps-positiva individer vid diagnos.

Slutligen är det av stor betydelse att öka vår kunskap om diabetesrelaterade markörer, såsom autoantikroppar, eftersom de är viktiga diagnostiska verktyg. Genom att studera autoantikropparnas roll för att förutspå T1D kan vi förhindra att barn som håller på att insjukna hamnar i ett livshotande tillstånd.

• author: Skärstrand, Hanna
• supervisor: Åke Lernmark; Fariba Vaziri Sani
• opponent: MD, PhD Mallone, Roberto, INSERM U1016 Cochin Institute, Paris, France
• organization: Celiac Disease and Diabetes Unit (research group); EXODIAB: Excellence of Diabetes Research in Sweden
• publishing date: 2014
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Clinical Medicine
• keywords: Minor autoantigens Neuropeptide Y., Affinity, ZnT8 autoantibodies, Autoimmune (type 1) diabetes
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2014:57
• pages: 184 pages
• defense location: Lilla Aulan at Jan Waldenströmsgata 5, Skåne University Hospital, Malmö
• defense date: 2014-05-16 13:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-87651-83-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: aa14180c-3520-4969-a02a-34cdcc7275a7 (old id 4406288)
• date added to LUP: 2016-04-01 12:56:19
• date last changed: 2023-04-18 20:47:49