Stability determinants and decay of Bacillus subtilis mRNAs

Abstract

Degradation of mRNA is a controlled process which is as important for gene regulation as the synthesis of mRNA. This thesis focuses on mechanisms of mRNA stability and degradation in Bacillus subtilis, the model of Gram-positive bacteria. The aprE mRNA, encoding an exported protease named subtilisin, is extremely stable with a half-life of more than 25 minutes. Average mRNA half-lives in B. subtilis are around 5 minutes. An aprE leader-lacZ mRNA is as stable as the native aprE mRNA, demonstrating that the aprE leader determines the extreme stability. Mutations were introduced into different domains of the aprE leader and measurements of the half-lives of the corresponding mRNAs showed that a 5’ stem-loop and ribosome loading are responsible for the extreme stability. The Gram-negative Escherichia coli is the bacterium where mRNA degradation is best known. We introduced the aprE leader-lacZ mRNA into E. coli to compare mRNA stability determinants in this bacterium and B. subtilis. The aprE leader mRNA has only average stability in E. coli, demonstrating that the two bacterial species have different mechanisms for mRNA degradation. The half-life of the mRNA is determined by RNase E, the major mRNA-degrading enzyme of E.coli. Moreover, a cleavage in the aprE leader mRNA that was observed in E. coli was not present in B. subtilis. This cleavage is performed by RNase G, an endonuclease homologous to the N-terminal domain of RNase E. Our findings are consistent with the fact that B. subtilis and E. coli have different arsenals of mRNA-degrading enzymes. Finally, we have employed microarrays to measure the stability of a large number of mRNAs in B. subtilis. In total, the stability of about 1500 mRNAs from bacteria in early stationary phase was estimated . This data set made it possible to do comparative analyses of stability determinants. However, so far we have not been able to find any elements that are unique for mRNAs belonging to a certain stability group.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Proteiner är nödvändiga beståndsdelar i en levande cell. Dels bygger de upp viktiga strukturer och dels katalyserar de kemiska reaktioner. Proteiner kodas av gener. Varje protein motsvaras av en gen. Vägen från gen till protein är densamma i alla organismer på jorden. Först transkriberas en gen till en molekyl kallad mRNA (budbärar-RNA, eng. messenger RNA). Detta mRNA avkodas sedan av ribosomer till protein. Cellen tillverkar bara de proteiner som behövs för tillfället. Att även tillverka andra proteiner skulle vara slöseri med energi. Celler reglerar alltså proteintillverkningen. Enkelt uttryckt kan man säga att ju mer mRNA som finns i cellen desto mer protein kommer det att bildas. Celler reglerar mängden mRNA både genom att variera synteshastigheten och nedbrytningshastigheten. I min avhandling har jag studerat mekanismer för hur nedbrytning av mRNA regleras.



Jag har studerat mekanismer för mRNA-nedbrytning i den ofarliga jordbakterien Bacillus subtilis. Anledning till att man gärna använder bakterier för molekylärgenetiska studier är att bakterier är relativt lätta att genmanipulera. Genom ganska enkla metoder kan man specifikt förändra geners utseende och funktion. Vidare är generationstiden för bakterier mycket kort. Vid optimala förhållanden delar sig vissa bakterier på mindre än 30 minuter. På bara några timmar kan man alltså relativt enkelt odla upp en mycket stor mängd genetiskt identiska bakterier.



Ett sätt att studera mekanismer för mRNA-nedbrytning är att undersöka stabiliteten hos olika mRNAn. mRNAn som är mycket stabila bryts ned långsamt, medan mRNAn som är instabila bryts ned fort. Jag har tittat på ett mRNA som normalt är mycket stabilt i Bacillus subtilis. Detta mRNA har jag sedan modifierat på specifika ställen. Genom att mäta stabiliteten hos dessa modiferade mRNAn har jag kunnat dra slutsatser om vilka delar på mRNAt som är speciellt viktiga för livslängden.



Jag har också jämfört hur samma mRNA bryts ned i B. subtilis och en annan bakterie Escherichia coli, som är den mest studerade av alla celler. Jag fann att dessa bakterier har olika mekanismer för mRNA-nedbrytning, vilket inte är förvåndande med tanke på att de skildes åt i sin utveckling för mer än en miljard år sedan. Ett annat sätt att lära sig mer om vad som bestämmer livslängden på ett mRNA är att jämföra ett stort antal mRNAn vars livslängder är kända. På så sätt kan man finna element som är unika för mRNAn med en viss livslängd. Problemet med denna metod är att man först måste veta livslängden på ett stort antal mRNAn. Detta har tidigare varit omöjligt eftersom det tar flera dagar att mäta livslängden på ett enda mRNA. Jag har använt mig av en ny metod som tillåter oss att mäta livslängden på alla mRNAn i en cell på mindre än en vecka. I B. subtilis finns det cirka 4000 mRNAn och av dessa har jag lyckats uppskatta livslängden på cirka 1500. Om denna information kan hjälpa oss finna element som är viktiga för livslängden för mRNAn är dock ännu för tidigt att säga.

• author: Hambraeus, Gustav
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Condon, Ciaran, Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris
• organization: Department of Biology
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: virology, mycology, Mikrobiologi, bakteriologi, virologi, mykologi, bacteriology, Microbiology, Bacillus subtilis, mRNA stability, degradation
• pages: 106 pages
• defense location: Biology lecture hall
• defense date: 2003-04-10 09:30:00
• ISBN: 91-628-5571-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Hambraeus, G., Persson, M. and Rutberg, B. (2000). The aprE leader is a determinant of extreme mRNA stability in Bacillus subtilis. Microbiol 146, 3051-3059 Article: II. Hambraeus, G., Karhumaa, K., and Rutberg, B. (2002). A 5’ stem-loop and ribosome loading but not translation are important for the stability of Bacillus subtilis aprE leader mRNA. Microbiol 148, 1795-1803 Article: III. Hambraeus, G. and Rutberg, B. (2003). Degradation of Bacillus subtilis aprE leader mRNA in Escherichia coli: roles of RNase E and RNase G. Manuscript The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Department of Cell and Organism Biology (Closed 2011.) (011002100)
• id: 39e1c00d-2aed-43f0-887e-7f202a948c6c (old id 465548)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:49:23
• date last changed: 2018-11-21 21:00:58