Phagocytosis by neutrophils - studies on phagosome dynamics and membrane traffic modulation by Streptococcus pyogenes

Abstract

Neutrophils are our most numerous and deadly white blood cells and without them we would succumb quickly

to infections by pathogens. The main mechanism that the neutrophils employ for our protection is

phagocytosis, where they eat and enclose their target inside a membrane-bound organelle, the phagosome.

Neutrophil phagosomes are highly dynamic entities, and a large amount of antimicrobial substances are

released to their interior within seconds of formation. In most cases this will kill the engulfed microbe, but

there are exceptions. Streptococcus pyogenes is one of our most common pathogens and is responsible for a

wide range of diseases. Recently it has been demonstrated that these bacteria are able to survive phagocytosis by

neutrophils. This doctoral thesis is about explaining those mechanisms.

What is described in this thesis is the development of new methods for studying phagosome biogenesis and

maturation, including creating magnetic bacteria to isolate phagosomes and advanced microscopy for live

measurements of phagosomal pH. The employment of cell lines and their differentiation into neutrophils is

shown to be a useful research tool. Using these methods, novel findings regarding mechanisms for fusion

between neutrophil granules and phagosomes are demonstrated. It is shown that S. pyogenes interfere with the

intracellular membrane traffic of neutrophils, leading to a decreased delivery of antimicrobial substances and

impaired acidification of S. pyogenes-containing phagosomes, helping them to survive phagocytosis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Hur lurar mördarbakterier våra celler?



Neutrofiler och fagocytos räddar liv

Utan vårt immunförsvar så skulle vi snabbt dö i infektioner från mikroorganismer. Det består ett

komplicerat system av celler och molekyler som tillsammans kan klara av att stå emot attacker från

bakterier, virus, svampar eller parasiter. Cellerna i immunförsvaret utgörs av vita blodkroppar

och den sort som det finns flest av är neutrofilen. Neutrofilen är en av våra ätarceller och har

som sin främsta uppgift att snabbt leta reda på farliga organismer, som t ex sjukdomsalstrande

bakterier och sen döda dem genom att äta upp dem. Denna process kallas fagocytos och inleds

med att molekyler på neutrofilens yta känner igen molekyler på bakteriens yta. Detta utlöser en

signaleringskaskad inuti neutrofilen som tills slut leder till att delar av cellmembranet omsluter

bakterien och knoppas av som en blåsa inåt i cellen; då har en fagosom bildats. Till fagosomen

skickas därefter en stor mängd farliga substanser för att döda bakterien och bryta ner den. Det

praktiska med en membranblåsa som fagosomen är att det som är farligt hålls isolerat för att inte

skada neutrofilen och omgivningen. I de allra flesta fall dödas bakterier snabbt och effektivt av

våra neutrofiler, men det finns undantag.



Streptokocker kan lura neutrofiler

Grupp A streptokocker, eller på latin Streptoccus pyogenes, är en våra vanligaste sjukdomsalstrande

bakterier och orsakar många sjukdomar, däribland halsfluss, scharlakansfeber och rosfeber. De

kan också orsaka väldigt allvarliga tillstånd som STSS (streptococcal toxic shock syndrome) och

nekrotiserande fasciit. Det sistnämnda är anledningen till att kvällstidningarna ofta benämner

dessa bakterier för “mördarbakterier” eller “köttätande bakterier”. Under de senaste åren har

det visat sig att dessa bakterier har mekanismer för att kunna överleva fagocytos av neutrofiler.

Eftersom neutrofilerna ofta är först på plats och äter upp bakterierna, så innebär det att

streptokockerna är skyddade från ytterliggare angrepp av immunförsvaret så länge de kan klara

sig i neutrofilerna.



Min avhandling handlar om att på molekylär nivå karakterisera hur S. pyogenes kan klara

av att bli uppätna av våra neutrofiler. Mycket av min doktorandtid har handlat om att

utveckla metoder för att kunna studera detta, vilket har lett till Arbete 1 och Arbete 2. De två

återstående arbetena beskriver nya fynd om hur neutrofilen fungerar under fagocytos (Arbete

3) och hur streptokocker kan påverka neutrofilen efter att ha blivit uppätna (Arbete 4). Dessa

arbeten sammanfattas nedan.



Verktyg 1 – Använda cancerceller och cancerbehandling för att studera neutrofiler

I Arbete 1 har vi visat att leukemi-celler kan användas som modell-system för att studera

fagocytos av S. pyogenes. Cancerceller kan under rätt betingelser leva hur länge som helst genom

att de delar sig hela tiden. Det är också det som är problemet med sådana celler i människor och som behandling finns det ibland medel som kan hindra dem från att dela sig. Vi har använt oss av leukemi-celler (HL-60) härstammande från en kvinna på sjuttiotalet och gett dessa en sådan celldelningshämmande substans, som är en variant av A-vitamin. Det som händer då är att de omogna HL-60 cellerna börjar mogna och bli mer och mer lika neutrofiler och därmed kan användas för att studera fagocytos.



Verktyg 2 – Skapa magnetiska bakterier för att isolera fagosomer

Det är en stor fördel att kunna analysera enbart fagosomer och på så sätt få reda på vilka ämnen

som samlas eller försvinner under tiden en bakterie befinner sig där. För att kunna göra detta med

bakterier visade det sig att det behövdes nya verktyg och den största delen av min doktorandtid

har bestått av att utveckla en ny metod för att isolera fagosomer. I Arbete 2 har vi visat att det

går att fästa in nanometer-stora magnetiska partiklar på ytan av bakterier. Med hjälp av detta

har vi sedan lyckats med att magnetiskt rena fram intakta bakterie-innehållande fagosomer från

neutrofiler. Detta kommer troligtvis att vara till stor glädje för forskningsfältet och har redan lett

till ökad förståelse kring hur fagocytos-processen fungerar i neutrofiler (se nedan).



Fynd 1 – Nya mekanismer för leverans av anti-bakteriella substanser till

fagosomer

När en neutrofil äter en bakterie och börjar skapa en fagosom så startar direkt en väldigt

omfattande förflyttning av andra membranblåsor (vesiklar och granula) som innehåller bl a

bakteriedödande ämnen. När dessa granula smälter samman med fagosomen möjliggör det

att neutrofiler kan döda och bryta ner bakterier. De mekanismer som styr sådan leverans till

cellytan (tidig fas) har i många fall antagits vara de samma som de till fagosomen (sen fas). I

Arbete 3 har vi genom att bl a använda vår metod för att isolera fagosomer funnit att leverans

av granula-innehåll skiljer sig åt om man jämför tidig och sen fas. Vi har visat att detta regleras

av olika mekanismer där leverans under den tidiga fasen är beroende av kalcium och vissa

membranstrukturer; leverans till fagosomen är däremot oberoende av dessa faktorer.



Fynd 2 – Streptokocker stör pH-mekanismer i fagosomen efter att ha blivit uppätna av neutrofiler

Koncentrationen av vätejoner, dvs pH, är centralt för hur en fagosom fungerar. Det är väldigt

svårt att studera, då man inte kan fixera vätejoner och de snabbt diffunderar i vätskor. För att

undersöka hur det ser ut i bakterie-innehållande fagosomer så har jag i Arbete 4 använt mig av

avancerad digital mikroskopi. Intensiteten på ljuset från vissa fluorescenta molekyler varierar

med pH. Genom att fästa sådana till bakterieytan och sedan fånga det fluorescerande ljuset med

en digital kamera går det med bildanalys att omvandla ljusintensiteten till pH-värden. Med hjälp

av ett specialutrustat mikroskop går detta att göra på neutrofiler som håller på att äta bakterier

och därmed mäta pH direkt i fagosomen. På detta sätt har jag kunnat visa att S. pyogenes hämmar

inflödet av vätejoner i fagosomen (och därmed håller pH högt) genom att förhindra leveransen

av vätejons-pumpar.

• author: Nordenfelt, Pontus
• supervisor: Hans Tapper; Lars Björck; Sergio Grinstein
• opponent: Prof Swanson, Joel, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, USA
• organization: Infection Medicine (BMC)
• publishing date: 2010
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Infectious Medicine
• keywords: fluorescence microscopy, membrane traffic, neutrophil, Streptococcus pyogenes, phagosome, phagocytosis
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2010:43
• pages: 204 pages
• defense location: GK-salen, BMC, Lund
• defense date: 2010-05-07 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86443-58-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 4ef6c9b4-0e7e-41e6-802d-7c077734a701 (old id 1585334)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:58:27
• date last changed: 2025-04-04 14:12:12