Identification of Virulence Factors in Nematode-Trapping Fungi - Insights from Genomics, Transcriptomics and Proteomics

Abstract

Nematode-trapping fungi are soil-living organisms with the unique ability to capture and infect free-living nematodes. The interest in studying these fungi arises from their potential use as biological control agents for plant- and animal-parasitic nematodes. To enter the parasitic stage, nematode-trapping fungi develop different kinds of trapping structures. In order to understand more about the evolution of parasitism in the nematode-trapping fungi and to identify virulence factors in these fungi genomic, transcriptomic and proteomic studies were conducted.



First, the genome of Monacrosporium haptotylum was sequenced and compared to the genome of the closely related Arthrobotrys oligospora and also to genomes of other ascomycetes. Two genomic mechanisms were identified that likely have been important for the adaptation to parasitism in these two nematode-trapping fungi. Firstly, the expansion of certain protein-domain families and a large number of species-specific genes indicated that gene duplications followed by functional diversification have played a major role in the evolution of the nematode-trapping fungi. Gene expression analyses indicated that many of these genes are important for pathogenicity. Secondly, comparisons of gene expression of orthologs between the two fungi during infection indicated that differential regulation was an important mechanism for the evolution of parasitism in nematode-trapping fungi.



Second, the proteome of the trapping structure in M. haptotylum was characterized using mass spectrometry. The trapping structure in this fungus is called knob and is a single cell that can be separated from the vegetative mycelia. The results showed that there was a large difference in the protein content of the knob and that of the mycelium. The knob proteome was overrepresented in secreted proteins, including small secreted proteins, peptidases and proteins containing the carbohydrate-binding domain WSC. Transcripts encoding such proteins were also highly upregulated in M. haptotylum during infection. We suggest that the knob contains many of the proteins needed in the early stages of infection.



Finally, to gain further insight about what genes that are generally regulated during infection we conducted a comparative transcriptome analysis of three nematode-trapping fungi infecting two nematode species. The analysis showed that the divergence in fungal interspecific gene expression was significantly larger than that related to the nematode host. We identified a core set of genes being expressed by all three fungi, and a more variable set being regulated depending on the fungal species or nematode host, respectively. The core set included several peptidases such as subtilisins and aspartic proteases but also ribosome-inactivating Ricin-B lectins. The variable set depending on the fungal species included fungal fruit-body lectins and D-mannose binding lectins. The host specific genes included glucosidases and genes encoding small secreted proteins.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Nematod-fångande svampar är en grupp av filamentösa svampar som lever i jorden. De kan som deras namn antyder fånga och infektera nematoder. Varför är det då viktigt att studera dessa svampar? Svaret är just nematoder. Nematoder, även kända som rundmaskar, kan infektera både människor, djur och växter. Vi i Europa är relativt förskonade mot dessa infektioner om man jämför med människor som lever i Asien, delar av Afrika samt delar av Amerika. Infektioner i boskap och grödor orsakar skador för miljardtals kronor varje år för dessa näringar. Det finns läkemedel för att bota dessa infektioner, och det går att bespruta grödor för att minska antalet nematoder. Nematodpopulationer har blivit mer och mer motståndskraftiga mot dessa läkemedel och en ökad efterfrågan av mer ekologiskt jordbruk har ökat behovet av en mer biologisk kontroll av dessa nematoder. De nematod-fångande svamparna är därav av intresse eftersom de är deras naturliga fiender. Redan på 1930-talet såg man denna potential och under 1980-talet så gjordes lyckade fältförsök där man kunde se att antalet nematoder i boskap minskade när man matade djuren med sporer av den nematod-fångande svampen Duddingtonia flagrans. Istället för att använda den levande svampen som kontrollmedel så har vi i vår forskning försökt att ta reda på vad det är i svampen som är skadligt för nematoden. Det kan i förlängningen leda till utveckling av läkemedel med nya verkningsmekanismer, eller möjlighet att genetisk modifiera en svamp så att den blir ännu bättre på att oskadliggöra nematoder.



Vi har tagit reda på vilka gener som den nematod-fångande svampen Monacrosporium haptotylum innehåller och gjort jämförelser med gen-innehållet hos andra svampar. Vi fann ett antal gen-familjer som har expanderat i M. haptotylum, som vi tror är viktiga för dess förmåga att infektera nematoder. När de expanderade gen-familjerna jämfördes med andra svampar var M. haptotylum mer lik växt-patogena svampar än djur-patogena svampar. M. haptotylum fångar nematoder med en knopp-liknande struktur. Den är en enkel cell som bildas från ett utskott av en hyf. Svampen utsöndrar ämnen så att nematoden lockas att komma nära, när knoppen får kontakt med nematoden klistrar den sig fast till nematoden via en okänd mekanism. Bindningen är väldigt stark och det kan hända att knoppen bryts loss från hyfen när nematoden kämpar för att komma därifrån. Knoppen kan då färdas med nematoden och sedan infektera den utan hjälp av mycelet. Via ett särskilt odlingssätt kan stora mängder av dessa fångstorgan produceras. Svampen får växa i en vätskekultur med luft som bubblar underifrån. Luftbubblorna gör att knopparna släpper och dessa kan sedan isoleras från mycelet genom filtrering. Det här ger en unik möjlighet att studera vilka proteiner som det finns mer av eller som kanske till och med är unika i knoppen jämfört med mycelet. Vi har undersökt både genuttryck och proteininnehåll i dessa knoppar, och jämfört med mycelet. Vi har även studerat genuttrycket specifikt under infektion och kommit fram till en lista med kandidater viktiga för denna svamps parasitära förmåga. Listan inkluderar proteiner som vi tror är viktiga för knoppens förmåga att kunna fästa till en nematod samt enzymer som behövs för att kunna penetrera nematodens yttre skikt.



En annan studie gjordes där genuttrycket hos tre andra nematod-fångande svampar undersöktes när de infekterade två olika arter av nematoder. Två av dessa svampar fångar nematoder på samma sätt som M. haptotylum, genom att klistra sig fast vid nematoden. Den tredje svampen har en spännande struktur som fångar nematoden mekaniskt. Dess fångstorgan består av tre celler som bildar en ring. När nematoden simmar in i ringen och nuddar cellerna så sväller cellerna på mindre än en sekund och nematoden fastnar. Ett antal gener identifierades i dessa studier som uttrycks oavsett typ av fångstorgan. Flera av dessa gener var liknande de gener som den knopp-bildande svampen uttryckte under infektion. En intressant grupp av gener som var högt uttryckt i alla tre svampar var de Ricin-liknande generna. Ricin är ett toxiskt ämne som utsöndras från ricinväxtens frön. Den är toxisk genom att den inhiberar syntesen av nya proteiner. De flesta generna i denna studie reglerades på samma sätt oavsett vilken nematod som svamparna infekterade. Dock så kunde ett litet antal gener urskiljas som reglerades olika. De inkluderade enzymer och även proteiner som binder kolhydrater. En teori är att de svampar som bildar adhesiva fångstorgan fångar nematoden genom proteiner på svampens yta som binder till kolhydrater på nematodens hud.



Sammanfattningsvis så har vi i dessa studier undersökt de molekylära mekanismerna som ligger bakom de nematod-fångande svamparnas förmåga att infektera nematoder. Ett antal gener har identifierats som vi tror är viktiga för infektionen. För att kunna verifiera dessa som virulensfaktorer så måste ytterligare experiment göras. Ett sätt är att slå ut en gen i taget så att inte proteinet som genen kodas för bildas. Sedan får svampen infektera nematoder, och virulensen jämförs med en svamp med korrekt genuppsättning. Ett annat sätt är att studera lokalisationen av proteiner under infektion. Genom att bilda antikroppar mot ett speciellt protein kan man med hjälp av fluorescensmikroskopi se var dessa proteiner är placerade under infektionen. Finner man en stark virulensfaktor i dessa experiment så kan det förhoppningsvis leda till ett första steg i utvecklingen av nya viktiga läkemedel.

• author: Andersson, Karl-Magnus
• supervisor: Anders Tunlid
• opponent: Assoc. Prof. Solomon, Peter, Research School of Biology, Australian National University, ACT, Canberra
• organization: Biodiversity; MEMEG; Department of Biology; Microbial Ecology (research group)
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Nematode-trapping fungi, comparative genomics, comparative transcriptomics, proteomics, virulence factors, parasitism
• pages: 198 pages
• defense location: Ecology building, Blue Hall, Sölvegatan 37, 223 62 Lund
• defense date: 2013-10-25 10:00:00
• ISBN: 978-91-7473-701-1
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 50493bf1-f536-4f4f-85df-795516130747 (old id 4065260)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:28:31
• date last changed: 2020-09-23 15:15:12