Skip to main content

Lund University Publications

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Hypoxia-induced phenotypic modulation of human neuroblastoma cells

Holmquist Mengelbier, Linda LU (2006)
Abstract
Neuroblastoma is a childhood tumour derived from cells of the sympathetic nervous system, which are arrested at low differentiation stages. Low differentiation stage and high tumour stage correlate to poor outcome. In earlier studies we have found that hypoxia induces dedifferentiation of neuroblastoma cells, which implies that hypoxia evokes a more aggressive phenotype. Here we employ microarray analysis to investigate the hypoxic effects, in neuroblastoma cells, on the expression of a larger set of genes. Genes involved in survival and treatment resistance were upregulated, which support the concept of an aggressive hypoxic phenotype. The microarray results further strengthened the concept of hypoxia-induced dedifferentiation of... (More)
Neuroblastoma is a childhood tumour derived from cells of the sympathetic nervous system, which are arrested at low differentiation stages. Low differentiation stage and high tumour stage correlate to poor outcome. In earlier studies we have found that hypoxia induces dedifferentiation of neuroblastoma cells, which implies that hypoxia evokes a more aggressive phenotype. Here we employ microarray analysis to investigate the hypoxic effects, in neuroblastoma cells, on the expression of a larger set of genes. Genes involved in survival and treatment resistance were upregulated, which support the concept of an aggressive hypoxic phenotype. The microarray results further strengthened the concept of hypoxia-induced dedifferentiation of neuroblastoma cells. Hypoxia-treated neuroblastoma cells were reoxygenated to determine the persistence of the hypoxic phenotype. Based on neuronal- and neural crest marker gene expression analysis, we conclude that the hypoxic phenotype persisted for at least 24 h upon reoxygenation. Hence, there was no selection for dedifferentiated cells; instead the hypoxic phenotype appears adaptable and dynamically reversible.



Major transcription factors that act in response to hypoxia are the hypoxia-inducible factors HIF-1a and HIF-2a. Intriguingly, HIF-2a, but not HIF-1a, was detected adjacent to blood vessels in neuroblastoma specimen, indicating a role for HIF-2a at more physiological oxygen levels. Analysis of HIF-protein levels in neuroblastoma cells exposed to hypoxia (1% O2) or 5% O2 (mimicking a more physiological oxygen level) revealed that HIF-1a is primarily and only transiently induced at 1% O2. HIF-2a, on the other hand, is induced at both 1 and 5% O2 and its protein levels increase over time. In a microarray analysis we extracted a set of genes with regulation patterns similar to that of the HIF-protein patterns seen in neuroblastoma cells grown at either 1 or 5% O2. We propose that the differences in HIF target gene utilization are dependent on time and oxygen conditions, rather than on target gene specificity. According to that concept, we propose that HIF-1a primarily drives gene transcription at acute hypoxia, while HIF-2a is active at prolonged hypoxia and at 5% O2, conclusions supported by HIF-1a and HIF-2a siRNA analyses and expression of the HIF-driven genes VEGF and DEC1/BHLB2.



Evaluation of a clinical neuroblastoma material showed correlation between HIF-2a immunostaining and poor patient outcome. Our results further implicate HIF-2a as a possible individual prognostic marker for neuroblastoma patients. Tumour growth of neuroblastoma cells knocked down for HIF-2a in nude mice was slower than neuroblastoma cells transfected with a scramble siRNA sequence. These observations support a role for HIF-2a in neuroblastoma progression. Immunostaining of neuroblastoma specimen revealed co-localization of VEGF and HIF-2a, suggesting a putative mechanism for neuroblastoma tumour growth due to HIF-2a-induced VEGF expression. Our results implicate an oncogenic role for HIF-2a in neuroblastoma aggressiveness, which might be exploited in the treatment of aggressive neuroblastomas. (Less)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING



Introduktion



Cancer uppstår när en cell i kroppen börjar dela sig okontrollerat, varmed det sker en onaturlig ansamling av celler ? tumörbildning. Solida tumörer t ex bröst- och prostatacancer är till skillnad från ickesolida tumörer som blodcancer/leukemi ofta dåligt försedda med syre på grund av långa avstånd mellan tumörceller och blodkärl. För att säkra syre- och näringsförsörjning kan tumörceller sätta igång nybildandet av blodkärl in i tumören. Tumörblodkärlen är dock omogna och deformerade i sin natur, vilket resulterar i läckande och inte fullt ut funktionella blodkärl. Dessa egenskaper stärker den dåliga tillgången... (More)
Popular Abstract in Swedish

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING



Introduktion



Cancer uppstår när en cell i kroppen börjar dela sig okontrollerat, varmed det sker en onaturlig ansamling av celler ? tumörbildning. Solida tumörer t ex bröst- och prostatacancer är till skillnad från ickesolida tumörer som blodcancer/leukemi ofta dåligt försedda med syre på grund av långa avstånd mellan tumörceller och blodkärl. För att säkra syre- och näringsförsörjning kan tumörceller sätta igång nybildandet av blodkärl in i tumören. Tumörblodkärlen är dock omogna och deformerade i sin natur, vilket resulterar i läckande och inte fullt ut funktionella blodkärl. Dessa egenskaper stärker den dåliga tillgången på syre, varmed hypoxi (syrebrist) uppstår. Hypoxi innebär ett syretryck på runt 1%, vilket är betydligt lägre än normalt syretryck i våra organ (fysiologiska syretryck på ca 5-6% syre).



I hypoxiska tumörområden aktiveras uttrycket av gener vars produkter, proteiner, hjälper cellen att anpassa sig till den onormalt låga syrenivån genom att trygga energitillgång och överlevnad. VEGF är en av de mest välundersökta generna som sätts igång vid hypoxi. VEGF driver nybildandet av blodkärl. Vid extra svår hypoxi (<1% O2) uttrycks istället proteiner som driver programmerad celldöd, apoptos. Aktivering av genuttryck, transkription, är beroende av transkriptionsfaktorer, vilka binder till DNA. Transkriptionsfaktorerna HIF-1a och HIF-2a ansamlas i stora mängder vid hypoxi och de kan båda driva VEGF-uttryck. Vid högre syretryck bryts HIF-1a och HIF-2a ner.



Neuroblastom är en solid barntumör (barncancer) som drabbar barn i åldern 0-15 år, med flest fall i åldern 0-3 år. I Sverige får varje år runt 15 barn diagnosen neuroblastom. Trots intensiva kirurgiska ingrepp och aggressiva cellgiftsbehandlingar överlever endast ca 50% av de barn som har de mest elakartade fallen av neuroblastom. Neuroblastom uppstår på de ställen i kroppen som det sympatiska nervsystemet utmynnar, dvs. i magtrakten, bäckenområdet. Mest vanligt är att den finns i binjurarna, körtlarna ovanför njurarna. Tumörcellerna kommer från just det sympatiska nervsystemet och består av nervceller som inte är färdigutvecklade utan har stannat upp i ett omoget stadie. Ju mindre mogna tumörcellerna är, desto aggressivare är de och desto sämre prognos har det drabbade barnet. I en tidigare studie har vår forskargrupp konstaterat att neuroblastomceller som utsätts för hypoxi blir än mer omogna än motsvarande celler som växer i en syrerik miljö. Detta tyder på en förhöjning av tumörcellernas aggressivitet.



Avhandlingens delarbeten



Arbete I är en fördjupad undersökning i uttrycket av ett stort antal gener i hypoxiska neuroblastomceller. Resultaten stödjer vår tidigare slutsats att hypoxi driver neuroblastomceller mot mer omogna karaktäristika. Dessutom såg vi att gener som bidrar till drogresistens uttrycks i större omfattning än vid högre syretryck. Sammantaget visar arbete I att även neuroblastomceller anpassar sig vid hypoxi genom att uttrycka gener som främjar överlevnad av tumörceller.



Framskridandet av cancer kan ske genom att den första tumören som uppstår, primärtumören, bildar öar av tumörceller, metastaser, placerade i andra vävnader i kroppen än där primärtumören uppstod. För att metastasering ska kunna ske krävs att tumörceller bryter sig loss från ursprungsvävnaden, och ut i blodomloppet. De följer blodflödet tills de stöter på en ny plast där de kan fortsätta sitt okontrollerade delande. Hypoxiska tumörceller som lyckas ta sig ut i ett blodkärl utsätts där för en omfattande ökning i syretryck. I arbete II studerade vi reoxygenering av hypoxiska tumörceller. För att se hur länge de hypoxiska neuroblastomcellerna bibehåller sina omogna karaktäristika vid höga syrenivåer har vi utsatt tumörceller för hypoxi (1% syre) och sen åter (re-) utsatt dem för högre syre(oxygen)-nivåer. Oavsett om vi utsatte cellerna för hypoxi i några dagar eller upp till två veckor eller i cykler av hypoxi och högt syretryck (normoxi) så återvände den cellen till sitt ursprungsläge efter ett dygns reoxygenering. Alltså var de hypoxiska neuroblastomcellernas karaktäristika reversibla. De bibehöll inte sina omgogna egenskaper när de utsatts för höga syrenivåer i mer än ett dygn. Tjugofyra timmar kan verka som en kort tid men det kan tänkas vara länge nog för en hypoxisk tumörcell att metastasera.



I arbete III studerar vi mer ingående HIF-1a och HIF-2a och hur de bidrar till att neuroblastomceller anpassar sig till syrebrist. Tidigare trodde forskningsgrupper att proteinerna HIF-1a och HIF-2a hade samma funktion eftersom de är mycket lika varandra, men mer och mer forskningsresultat stödjer hypotesen att de har olika uppgifter. Våra resultat indikerar att HIF-1a utför sitt arbete vid akut syrebrist vilket kan uppstå under korta perioder i en tumör när t ex ett blodkärl tillfälligt blir tilltäppt. I motsats till HIF-1a tar HIF-2a tar över och arbetar vid långvarig syrebrist vilket tumörer utsätts för när tumörceller under en längre tid har dålig tillgång på syre. Vid närmare studier av tumörmaterial från neuroblastom fann vi dessutom HIF-2a protein i tumörområden nära blodkärl, dvs. i områden som förväntas vara välförsedda med syre. Vanligtvis hittar man bara HIF-1a och HIF-2a i dåligt syresatta (hypoxiska) tumörområden, därför var det ett oväntat resultat att se HIF-2a i väl syresatta tumörområden. Genom att i laboratoriet odla neuroblastomceller vid 5% syre, ett syretryck som motsvarar det fysiologiska syretryck som finns i kroppens friska organ, konstaterade vi att HIF-2a, men inte HIF-1a ansamlas vid bättre tillgång till syre. Genom att studera ett större patientmaterial fann vi att höga HIF-2a-nivåer är kopplat till en sämre prognos för patienterna. Dessa resultat kan komma att bli viktiga vid framtida bedömningar av neuroblastompatienters överlevnadschanser.



De tre studierna som ingår i avhandlingen utgör pusselbitar i det ständigt pågående arbetet med att kartlägga varför neuroblastom är en så aggressiv cancerform. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Prof. Harris, Adrian L., Oxford
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Medicin (människa och djur), Medicine (human and vertebrates), reoxygenation, HIF-2a, HIF-1a, differentiation, hypoxia, neuroblastoma
pages
110 pages
publisher
Department of Laboratory Medicine, Lund University
defense location
Föreläsningssalen, Patologihuset, Universitetssjukhuset MAS, Malmö.
defense date
2006-12-01 09:15:00
ISBN
91-85559-53-9
language
English
LU publication?
yes
additional info
The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Molecular Medicine (013031200)
id
b9d9d2cd-9e5b-41e3-8fac-8bcd9af20269 (old id 547587)
date added to LUP
2016-04-01 16:20:07
date last changed
2018-11-21 20:40:36
@phdthesis{b9d9d2cd-9e5b-41e3-8fac-8bcd9af20269,
  abstract     = {Neuroblastoma is a childhood tumour derived from cells of the sympathetic nervous system, which are arrested at low differentiation stages. Low differentiation stage and high tumour stage correlate to poor outcome. In earlier studies we have found that hypoxia induces dedifferentiation of neuroblastoma cells, which implies that hypoxia evokes a more aggressive phenotype. Here we employ microarray analysis to investigate the hypoxic effects, in neuroblastoma cells, on the expression of a larger set of genes. Genes involved in survival and treatment resistance were upregulated, which support the concept of an aggressive hypoxic phenotype. The microarray results further strengthened the concept of hypoxia-induced dedifferentiation of neuroblastoma cells. Hypoxia-treated neuroblastoma cells were reoxygenated to determine the persistence of the hypoxic phenotype. Based on neuronal- and neural crest marker gene expression analysis, we conclude that the hypoxic phenotype persisted for at least 24 h upon reoxygenation. Hence, there was no selection for dedifferentiated cells; instead the hypoxic phenotype appears adaptable and dynamically reversible.<br/><br>
<br/><br>
Major transcription factors that act in response to hypoxia are the hypoxia-inducible factors HIF-1a and HIF-2a. Intriguingly, HIF-2a, but not HIF-1a, was detected adjacent to blood vessels in neuroblastoma specimen, indicating a role for HIF-2a at more physiological oxygen levels. Analysis of HIF-protein levels in neuroblastoma cells exposed to hypoxia (1% O2) or 5% O2 (mimicking a more physiological oxygen level) revealed that HIF-1a is primarily and only transiently induced at 1% O2. HIF-2a, on the other hand, is induced at both 1 and 5% O2 and its protein levels increase over time. In a microarray analysis we extracted a set of genes with regulation patterns similar to that of the HIF-protein patterns seen in neuroblastoma cells grown at either 1 or 5% O2. We propose that the differences in HIF target gene utilization are dependent on time and oxygen conditions, rather than on target gene specificity. According to that concept, we propose that HIF-1a primarily drives gene transcription at acute hypoxia, while HIF-2a is active at prolonged hypoxia and at 5% O2, conclusions supported by HIF-1a and HIF-2a siRNA analyses and expression of the HIF-driven genes VEGF and DEC1/BHLB2.<br/><br>
<br/><br>
Evaluation of a clinical neuroblastoma material showed correlation between HIF-2a immunostaining and poor patient outcome. Our results further implicate HIF-2a as a possible individual prognostic marker for neuroblastoma patients. Tumour growth of neuroblastoma cells knocked down for HIF-2a in nude mice was slower than neuroblastoma cells transfected with a scramble siRNA sequence. These observations support a role for HIF-2a in neuroblastoma progression. Immunostaining of neuroblastoma specimen revealed co-localization of VEGF and HIF-2a, suggesting a putative mechanism for neuroblastoma tumour growth due to HIF-2a-induced VEGF expression. Our results implicate an oncogenic role for HIF-2a in neuroblastoma aggressiveness, which might be exploited in the treatment of aggressive neuroblastomas.},
  author       = {Holmquist Mengelbier, Linda},
  isbn         = {91-85559-53-9},
  language     = {eng},
  publisher    = {Department of Laboratory Medicine, Lund University},
  school       = {Lund University},
  title        = {Hypoxia-induced phenotypic modulation of human neuroblastoma cells},
  url          = {https://lup.lub.lu.se/search/files/4641291/547588.pdf},
  year         = {2006},
}