Respiratory NAD(P)H dehydrogenases of plants - Gene identity and expression in response to light and cold

Abstract

The respiratory chain of plants contains class 2 NAD(P)H dehydrogenases, not present in animals. The functional roles of these enzymes have been elusive for a long time. Two cDNAs, homologous to class 2 NADH dehydrogenase genes of yeast and E. coli, were isolated from potato leaves. The gene products, NDA1 and NDB1, were shown to reside on the internal and external sides of the inner mitochondrial membrane, respectively. As fusion proteins expressed in E. coli, the NDA1 protein was more firmly attached to membranes than the NDB1 protein. To study gene expression at the RNA level, a competitive quantitative RT-PCR system was developed. The nda1 gene was shown to be completely dependent on light. This light-dependence was seen at the mRNA, protein and activity levels. The nda1 gene was also seen to display a diurnal rhythm in potato leaves. As leaves develop from young to mature, the NDA1 transcript increases. This increase is reflected at the protein and activity levels. A real-time PCR system was developed for further transcript analyses. At cold-stress of potato plants, a decrease of NDA1 transcript was seen with consistent effects at the protein and activity levels. In the Arabidopsis genome, seven potential class 2 NAD(P)H dehydrogenase genes were identified. One of these genes, At-nda1 is regulated by light. The NDA1 enzyme is suggested to have a photorespiratory role, oxidizing excessive NADH in potato leaf mitochondria during photosynthesis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Respirationen i både växter och djur kan delas upp i tre delar: glykolysen, citronsyracykeln och elektrontransportkedjan. Glykolysen sker i cytoplasman (cellvätskan), medan citronsyracykeln och elektrontransportkedjan verkar i mitokondrierna. Mitokondrier fungerar som cellernas motorer. De är ungefär lika viktiga för cellen som motorn är för en bil. Mitokondrierna är små (ca 1-3 mikrometer på längden) och det kan finnas flera hundra av dem inne i en enda cell. Varje mitokondrie omges av två membran, varav det inre är kraftigt veckat.



Respirationen går ut på att energi i kolhydrater omvandlas till energi i ATP-molekyler. Nästan alla uppbyggande processer i cellen, t. ex. DNA-, protein eller fettsyntes, kräver ATP som energikälla. Då syre finns tillgängligt i cellen, produceras ATP till stor del via elektrontransportkedjan, som återfinns i mitokondriernas inre membran. Växternas elektrontransportkedja innehåller extra enzymer jämfört med djurens. Under min doktorandtid har jag ägnat mig åt de extra enzymerna, för att förstå vad de har för funktion i växten.



De extra enzymerna i växternas elektrontransportkedja består av NAD(P)H-dehydrogenaser samt det alternativa oxidaset. De här enzymernas aktivitet gör att energiomvandlingen, som leder till produktion av ATP, till synes blir mindre effektiv. Vilken nytta gör de i växterna?



Från potatisblad isolerade vi DNA-bitar, som troligen motsvarar två av växternas extra NAD(P)H-dehydrogenaser. DNA-isoleringen var möjlig tack vare att andra forskare tidigare hade identifierat liknande gener i en bakterie och i en jästsvamp. Vi visade att vårt DNA var mycket likt DNAt från bakterien och jästsvampen (Artikel I). Med experiment kunde vi också visa att enzymerna, som motsvarar våra DNA-bitar, hamnar på olika sidor av det inre mitokondriemembranet. Då E. coli-bakterier fick tillverka ”våra enzymer”, såg vi att det ena enzymet (NDA1) är starkare kopplat till membran jämfört med det andra (NDB1).



Gener i levande organismer är aktiva i olika grad. Ibland kan en gen helt stängas av. Ett sätt att mäta en gens aktivitet är att ta reda på koncentrationen av RNAt, som hör till genen. Då vi satte potatisplantor i mörker tre dygn, såg vi att det nästan inte fanns något RNA kvar för nda1-genen, medan de tre andra undersökta genernas RNA låg kvar på samma nivå som före mörkerbehandlingen. När potatisplantorna sattes ut i ljus igen, steg RNA-koncentrationen för nda1-genen snabbt. Alltså är nda1-genen beroende av ljus för att vara aktiv (Artikel II). Vi visade också att nda1-genens ljusberoende får konsekvenser för hur mycket NDA-protein som finns, och hur stor kapacitet växten har att oxidera NADH via ett extra NADH-dehydrogenas. Ljusberoendet för nda1-genen antyder, att motsvarande enzym har en funktion kopplad till fotosyntesen. I växtbladsmitokondrier finns så kallade fotorespiratoriska enzymer. De är endast aktiva vid fotosyntes. Mycket tyder på att NDA1-enzymet har en fotorespiratorisk roll. Det kan vara viktigt för att undvika en skadligt hög koncentration av NADH inne i växtbladsmitokondrier. För att kunna bevisa att NDA1-enzymet har en fotorespiratorisk funktion, behöver dock fler experiment göras.



Då vi utsatte potatisplantor för kyla (5ºC), visade det sig att nda1-genens aktivitet minskade. Vi såg också att minskningen syntes på protein- och enzymaktivitetsnivå (Artikel III). Den här minskningen kan bero på lägre fotorespiratorisk aktivitet i samband med kyla. Alternativt gör minskningen att växten begränsar bildningen av skadliga fria radikaler.



I den här avhandlingen visar jag att det också finns en ljusreglerad nda1-gen i Arabidopsis (backtrav), som är ett oansenligt ogräs. Väldigt många växtforskare ägnar sig åt backtrav och dess gener, för att det är en tacksam växt att jobba med. Den är lättodlad och växer snabbt. Dessutom innehåller den relativt lite DNA. Allt DNA i backtrav är nu sekvenserat. Med andra ord är det lättare att studera enskilda gener i backtrav än i andra växter. Om vi förstår hur generna fungerar i backtrav, kommer vi att kunna tillämpa den kunskapen på ekonomiskt betydande växter. Ljusregleringen av nda1-genen i backtrav antyder, att det finns ljusreglerade nda1-gener i stora delar av växtriket, eftersom potatis och backtrav är avlägsna släktingar. I backtrav hittade vi totalt sju gener, som troligen kodar för extra NAD(P)H-dehydrogenaser.



Många viktiga experiment kvarstår för att kartlägga generna, som kodar för växternas extra NAD(P)H-dehydrogenaser, men nu har vi kommit en bit på väg.

• author: Svensson, Staffan
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Boutry, Marc, Unité de Biochimie Physiologique, Université Catholique de Louvain, Belgium
• organization: Department of Biology
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: morfologi, phytogeography, chemotaxonomy. Physiology of nonvascular plants, Systematisk botanik, taxonomi, morphology, taxonomy, Systematic botany, Växtgenetik, Plant genetics, plant mitochondria, NADH dehydrogenases, light dependence, mRNA quantification, leaf respiration, cold treatment, kemotaxonomi. Växters fysiologi (inte kärlväxter).
• pages: 82 pages
• defense location: Blå Hallen, the Ecology Building, Sölvegatan 37, Lund, Sweden
• defense date: 2002-06-07 13:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUNBDS/(nbfb-1040)1-82(2002)
• ISBN: 91-628-5269-8
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Rasmusson, A.G., Svensson, Å.S., Knoop, V., Grohmann, L. and Brennicke, A. (1999) Homologues of yeast and bacterial rotenone-insensitive NADH dehydrogenases in higher eukaryotes: two enzymes are present in potato mitochondria. Plant J. 20, 79-87. Article: II. Svensson, Å.S. and Rasmusson, A.G. (2001) Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves. Plant J. 28, 73-82. Article: III. Svensson, Å.S., Johansson, F.I., Møller, I.M. and Rasmusson, A.G. (2002) Cold stress decreases the capacity for respiratory NADH oxidation in potato leaves. FEBS Lett. 517, 79-82.
• id: 6104062f-13ef-4e01-b836-78aa63b850f3 (old id 464707)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:00:15
• date last changed: 2018-11-21 21:08:27