Plant Membrane Proteomics - using isolated membranes and proteins to compare and quantify subproteomes

Abstract

Membrane proteins are particularly important to characterize, since they are involved in cellular processes of utmost importance in control and regulation of cells, such as transport across membranes, signal transduction and photosynthesis. The word "proteome" means all proteins expressed by a e.g. a cell or a tissue, at a certain time point and "proteomics" is the large scale study of these proteins. This thesis concerns mass spectrometry based quantitative proteomics of isolated plant membranes and proteins to gain more insights into the subproteomes. An important prerequisite for the investigations of plant plasma membrane (PM) subproteomes is the isolation of pure membranes, which we obtained by using aqueous two-phase partitioning (paper I). By using highly pure membranes, we were able to identify and quantify tissue specific isoforms in both poplar (Paper II) and Arabidopsis (Paper III). A large number of proteins, unique to the wood-forming xylem PM of poplar, were identified. We applied a quantitative approach using metabolic labeling and mass spectrometric determination of 14N/15N-ratios to determine the distribution differences for e.g. PM aquaporin isofoms, between leaf and root tissue in Arabidopsis (Paper III). Focus was then shifted to the Arabidopsis subproteome and the chloroplast-localized small heat shock protein, Hsp21 (Paper IV). This protein is plays a crucial role for plant survival during periods of stress, by interacting with and preventing stress-sensitive proteins from unfolding. Using our metabolic labeling approach and 14N/15N-ratios, we could detect and quantify the translocation of Hsp21 from the soluble stromal phase to the thylakoid membrane in heat-stressed plants, which was quite unique for Hsp21 compared to other thylakoid membrane proteins (Paper V). Quantitative proteomics using metabolic labeling and 14N/15N-ratios has proven to be a robust and useful tool to investigate differences in plant subproteomes and to investigate the location, abundance and behavior of membrane proteins both in vivo and in vitro.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Proteiner är den huvudsakliga beståndsdelen i levande celler. Proteiner består av långa kedjor av aminosyror som sitter ihop med peptidbindningar och vecklar ihop sig till komplicerade tre dimensionella strukturer. Proteiner är involverade i praktiskt taget alla mekanismer och funktioner i cellen. När man studerar hela proteinsammansättningen i t.ex. ett organ, en speciell sorts celler eller en speciell del av cellen kallas detta för proteomik. När man utför en proteomik studie analyserar man tusentals proteiner på en gång.

När man utför kvantitativa proteomik studier jämför man vilka olika proteiner man hittar och hur mycket man kan hitta av var och en av dem, i två eller fler prover som jämförs. Om man jämför en frisk cell och en sjuk cell så kan man mäta vilka proteiner som saknas eller om det finns fler proteiner av en viss sort i den sjuka cellen. Man kan därmed dra en slutsats vilka proteiner som är viktiga för cellen vid detta sjukdomstillstånd och kunna förstå deras funktion.

Ett sätt att identifiera och mäta proteiner är med hjälp av en teknik som heter masspektrometri (MS). Först delar man proteinet i mindre beståndsdelar, peptider, med hjälp av ett enzym som katalyserar nedbrytningen av peptidbindningar vid specifika aminosyror. När hela proteinet i provet är nedbrutet till peptider introducerar man provet till masspektrometern. Peptiderna omvandlas där till gasjoner som med hjälp av ett elektroniskt fält börjar flyga genom ett långt rör med vakuum. Peptiderna kommer att ha olika hastigheter beroende på hur många laddningar de har och hur stora de är, mindre peptider kommer fram fortare än större peptider och peptider med fler laddningar kommer fram fortare än de med färre. Genom att mäta tiden det tog för peptiden att flyga genom röret och nå detektorn, kan man beräkna hur stor peptiden är, med en noggrannhet på ppm (dvs miljondelar). När den inre energin i peptiden blir tillräckligt hög bryts peptiden sönder till mindre fragment, detta kallas MS/MS. Genom att mäta peptiderna och deras fragment kan man bestämma vilken aminosyrasekvens peptiden har och därigenom identifiera vilka proteiner man har i sitt prov.

Växten Arabidopsis är en av de vanligaste modellorganismer inom forskning eftersom den är liten, har en kort livscykel och en enkel arvsmassa, bara 125 miljoner baspar istället för människans 3 miljarder baspar. Kan man kartlägga vad alla generna i Arabidopsis har för funktion kan man applicera denna kunskap på andra organismer, t.ex. människan och därigenom förstå vad som sker på proteinnivå i oss. Jag har i mitt avhandligsarbete främst arbetat med membranproteiner som är placerade i cellens olika membran och har som funktion att transportera vissa ämnen över membranet eller ta emot signaler och skicka vidare dem i cellen. De flesta läkemedlen är riktade mot membranproteiner därför är dessa mycket viktiga att kartlägga och förstå.

Vi odlar en population i ett vanligt medium och en annan population, som vi kan t.ex. utsätta för en stress eller behandling, odlas i ett annat medium där vi bytt ut det vanliga kvävet (14N) mot en stabil kväve isotop som istället för 7 protoner och 7 neutroner nu innehåller 7 protoner och 8 neutroner (15N) och därmed väger 1u mer. Alla proteiner som kommer från organismer som vuxit i 15N medium kommer nu att väga 1u mer per kväve de innehåller, vilket blir synligt i masspektrometern. Genom att blanda ihop prov från det vanliga 14N provet och det behandlade 15N provet och jämföra peptiderna från de båda populationerna kan skillnader i proteinsammansättningen bestämmas. Detta är ett sätt att förstå skillnaden i olika delar av cellen eller vad som händer i cellen när den utsätts för t.ex. värme, vilka proteiner det bildas mer av och vilka proteiner som degraderas cellen ska överleva.

I mitt avhandligsarbete har jag utvecklat och använt ett experimentellt tillvägagångssätt för att studera membran proteiner i celler framför allt i plasma membran, som är de yttre membran som skiljer cellen från dess omgivning. Jag har med hjälp av mass spektometri undersökt olika sorters celler och vävnader för att identifiera vilka proteiner som är gemensamma för alla plasma membran och vilka proteiner som är unika i plasma membranen i vissa celler och vävnader. Jag har även undersökt hur proteinerna är fördelade dvs. hur mycket finns det av ett visst protein i en viss sorts cell i förhållande till en annan sorts cell med 14N/15N metoden som är beskriven ovan. Med denna metod har jag även undersökt hur proteiner beter sig i olika delar av cellen då en organismen utsätts för vissa stressmoment, t.ex. värmestress.

• author: Bernfur, Katja
• supervisor: Cecilia Emanuelsson
• opponent: Dr Palmblad, Magnus, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2014
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Mass spectrometry, quantification, proteomics, metabolic labeling, plasma membrane
• pages: 168 pages
• defense location: Lecture hall B, Centre for Chemistry and Chemical Engineering, Lund
• defense date: 2014-09-12 10:30:00
• ISBN: 978-91-7422-361-3
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 7d7a3920-40f0-4c67-aef4-ac7a1ebf2699 (old id 4586893)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:17:48
• date last changed: 2018-11-21 21:03:54