Novel insights into the role of serotonin in control of β-cell fuction

Abstract

Inadequate insulin secretion is a central component in the development of Diabetes Mellitus, resulting from reduced pancreatic β-cell mass, as well as diminished β-cell function. Islet produced 5-hydroxy tryptamine (5-HT) is suggested to regulate insulin secretion and β-cell mass in rodents during pregnancy and in metabolically challenged states. However, the role of 5-HT in control of insulin release in humans is still controversial. Virtually all 5-HT receptors are coupled to G-proteins and activate different second messenger systems, with the exception of the 5-HT3-receptor family which are ligand-gated ion channels. In this thesis I have studied 5-HT signaling in human islets of Langerhans employing a number of physiological and biochemical techniques. Moreover, different pharmacological compounds targeting specific 5-HT receptors to improve insulin release are investigated.

A complete transcriptional mapping of 5-HT receptors in human islets of Langerhans revealed expression of fourteen 5-HT receptors, as well as the enzymes involved in the biosynthesis of 5-HT. Two 5-HT receptor genes (HTR1D and HTR2A) were over-expressed in type 2 diabetic (T2D) islet donors and while 5-HT inhibited both insulin and glucagon secretion in non-diabetic islet donors, 5-HT increased the release of insulin in response to glucose in diabetic T2D islet donors. When investigating the specific function of receptors 5-HT1d and 5-HT2a in non-diabetic islets, we found that a 5-HT1d receptor agonist inhibited insulin release, while a 5-HT1d antagonist potentiated insulin release. Similarly, a 5-HT2a receptor agonist significantly potentiated insulin release, and an antagonist blunted the response of insulin to glucose.

When stimulating human and mouse islets, as well as INS-1 (832/13) cells with a specific 5-HT2b receptor agonist GSIS was enhanced. Moreover, silencing Htr2b in INS-1 (832/13) cells resulted in a 30% reduction in GSIS. In addition, 5-HT2b receptor-activation produced robust, regular and sustained Ca2+ oscillations, paralleled with an increase in oxidative consumption rate in mouse islets.

In vivo studies showed that AMS significantly decreased the insulinogenic index in AMS treated HFD fed mice as compared to untreated mice. Moreover, isolated pancreatic islets from AMS-treated mice given a control diet secreted less insulin in response to glucose compared to islets from untreated control diet fed mice.

Taken together, we show that differential expression levels of 5-HT receptors have functional consequences on islet hormone secretion that may contribute to islet dysfunction as observed in T2D. Furthermore, we provide evidence for an important role of 5-HT2b receptor signaling in control of insulin secretion in vitro. In conclusion, our data suggests an important role for 5-HT signaling in control of islet hormone secretion.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Diabetes mellitus är en samling sjukdomar som karaktäriseras av förhöjt blodsocker. Traditionellt har man delat upp sjukdomen i två former; typ 1 och typ 2 diabetes. Vid typ 1 diabetes förstörs de insulinproducerande β-cellerna i bukspottskörteln av kroppens immunförsvar och sjukdomen debuterar ofta tidigt i livet. Typ 2 diabetes, tidigare ofta benämnd ”åldersdiabetes” drabbar idag individer i alla åldrar och är kraftigt associerad med övervikt. Förekomsten av typ 2 diabetes ökar dramatiskt över hela världen och leder till ökad risk för dödlighet i de komplikationer som följer av sjukdomen.

Insulin har en livsavgörande funktion för att kroppens celler ska kunna tillgodose sitt energibehov. Insulin signalerar till cellerna att ta upp och lagra socker som glykogen i lever och skelettmuskulatur och även som fett, triglycerider i fettvävnaden. Eftersom socker är den primära energikällan för kroppen och hjärnan, är det oerhört viktigt att upprätthålla en stabil sockernivå i blodet. Mellan måltider upprätthålls blodsockerbalansen genom att hormonet glukagon, från öarnas α-celler, stimulerar levern att frisätta lagrad energi i form av socker till blodbanan.

Vid förhöjt blodsocker ska kroppen normalt svara genom att öka frisättningen av insulin. När kroppens celler inte kan svara på det insulin som tillhandahålls av β-cellerna för att öka upptaget av socker kallas det insulinresistens. Insulinresistens bidrar till att öka belastningen på β-cellerna som försöker kompensera med att utsöndra mer insulin och när detta inte längre är tillräckligt utvecklas typ 2 diabetes.

Vid förhöjt blodsocker under en längre tid kan komplikationer uppstå. Då börjar andra organ att påverkas och i förlängningen leder detta till svåra följdsjukdomar, såsom hjärt-kärlsjukdomar, ögon-, nerv- och njursjukdomar.

Serotonin

Serotonin (5-HT) är en signalsubstans som har viktiga funktioner i hjärnan, mag-tarmkanalen och blodcirkulationen. Serotonin kontrollerar aptit, sömn, minne, inlärning, temperaturreglering, humör och beteende på en central nivå. Serotonin är också mycket viktigt för att hålla kroppens funktioner i balans såsom blodtrycksreglering, hjärt-kärlfunktioner och även tarmrörelser i magtarmkanalen. Serotonin är väl studerat i hjärnan i samband med depression, schizofreni och ämnesomsättning, men är i mindre grad utforskat i när det gäller de Langerhanska öarna och dess celler. För att serotonin ska utöva effekt binder serotonin till en receptor. Det finns 7 olika 5-HT-receptorfamiljer med flera deltyper i varje familj. Dessa aktiverar/inaktiverar olika signalvägar i cellerna och kan påverka den intracellulära miljön på olika sätt.

Tidigare studier har visat att 5-HT-receptorerna 1d, 2a och 2b uttrycks i Langerhanska öar där de insulinproducerande β-cellerna finns. I studier publicerade för några år sedan påvisades att serotonin tillsammans med hormoner som reglerar bröstmjölksproduktion kan bidra till den naturliga ökningen av β-celler som sker under en graviditet. En av dessa studier visade att 5-HT-receptor 2b var viktig för att β-cellerna skulle öka i antal och att 5-HT-receptor 1d var viktig för att β-cellerna skulle återställas till ett normalt antal igen efter en graviditet. Om inte denna reglering fungerar kan graviditetsdiabetes utvecklas. Även 5-HT-receptor 3a har visats vara viktig för att bibehålla adekvat insulinfrisättning vid graviditet såväl som för normal insulinfrisättning.

Serotonin i Langerhanska öar

5-HT-receptorernas funktion i humana Langerhanska öar är inte helt klarlagd. I den första studien utredde vi i detalj vilka 5-HT-receptorer som finns uttryckta i Langerhanska öar från människa. Vidare studerade vi förändringar i uttrycket av dessa receptorer i öar från friska individer och från individer med typ 2 diabetes. En kartläggning av 5-HT-receptorerna visade att 14 receptorer till vilka serotonin binder, samt tre enzym involverade i biosyntesen av serotonin, finns uttryckta i de Langerhanska öarna hos människa. Kartläggningen visade också att 5-HT-receptor 1d och 2a var uppreglerade i öar hos individer med typ 2 diabetes. Genom att studera bukspottskörtlar ifrån människor kunde 5-HT-receptor 1d och 2a observeras i både de insulinproducerande β-cellerna och de glukagonproducerande α-cellerna. Dessa receptorer har därmed möjlighet att påverka öarnas funktion.

Serotonin hämmar insulin- och glukagonfrisättningen i friska öar. Dock stimulerar serotonin insulinfrisättningen i typ 2 diabetes-öar. Detta kan verka paradoxalt, flertalet studier har tidigare visat att serotonin nedreglerar insulinfrisättningen i mus och råtta, samtidigt har serotonin även setts stimulera insulinfrisättning. Detta kan bero på den stora mängden olika receptorer som uttrycks i Langerhanska öar samt skillnader mellan olika arter. Dessutom kan farmakologiska agonister eller antagonister, som binder till de olika 5-HT-receptorerna och aktiverar olika intracellulära system kan ge ökad eller minskad insulinutsöndring från β-cellerna. Sådana agonister och antagonister användes för att kartlägga receptorernas funktion i Langerhanska öar från människa.

TCB-2 är en agonist för 5-HT-receptor 2a som stimulerar frisättning av insulin och antagonisten EMD281014 blockerar receptorn vilket resulterar i en minskad insulinutsöndring. Agonisten PNU142633 användes för att aktivera 5-HT-receptor 1d vilket resulterade i en minskad insulinfrisättning och när antagonisten LY310762 användes stimulerades insulinfrisättningen från de humana Langerhanska öarna.

Denna studie ger viktig kunskap om hur serotonin i öar påverkar utsöndringen av insulin och även utsöndringen av glukagon. Här visade vi hur två av de 14 receptorer som finns uttryckta kan påverka insulinfrisättningen både positivt och negativt. Vi visade även att serotonin ökar insulinfrisättningen i typ 2 diabetes-öar, vilket möjligen är en konsekvens av att två 5-HT-receptorer är överuttryckta och förändrar det normala effekterna av serotonin. I förlängingen kan denna förändring resultera i minskad kontroll av insulinfrisättningen från kroppens β-celler och bidra till utvecklingen av typ 2 diabetes.

5-HT-receptor 2b stimulerar insulinfrisättning in vitro

5-HT-receptor 2b har i tidigare studier visats vara involverad i reglering av antalet β-celler under en graviditet. Genom att studera bukspottskörtlar från människor har vi sett att 5-HT-receptor 2b endast finns uttryckt i β-celler. α-metylserotonin maleate salt (AMS), är en agonist som aktiverar 5-HT-receptor 2b. Genom att aktivera denna receptor med AMS kunde vi påvisa vilka intracellulära mekanismer som sannolikt aktiveras. Aktiveringen leder till ökad frisättning av insulin i mus och öar ifrån människor och även i INS-1 β-celler som är en cellinje utvecklad från råttceller.

För att studera de intracellulära signalvägarna som stimulerades med AMS undersöktes mitokondriens funktion. En förbättrad mitokondriefunktion kunde observeras efter tillsättning av AMS. Även förändringar av kalciumnivåer i cellen kunde observeras efter aktivering av 5-HT receptor 2b. När 5-HT-receptor 2b nedreglerades kunde en hämning av insulinfrisättning påvisas, och denna minskning av insulin kunde inte förbättras genom att tillsätta agonisten AMS.

Denna studie ger viktig kunskap om lokalisering, funktion och signalvägar för 5-HT-receptor 2b i human-öar, mus-öar och även i INS-1 β-celler. Dessutom visar den att genom att manipulera dessa system kan man förbättra β-cellens insulinfrisättning. Detta utgör därmed en möjlig strategi för att utveckla läkemedel för typ 2 diabetes.



5-HT-receptor 2b – en in vivo studie

I den tredje studien undersökte vi hur AMS påverkar sockerbalansen i möss som gjorts insulinresistenta genom att äta en kost med ett högt kaloriinnehåll. Våra resultat visade att AMS delvis kan motverka insulinresistens. Vi visar att möss som äter en högkaloridiet tar upp socker bättre efter behandling med AMS jämfört med möss som bara går på en högkaloridiet och inte får behandling med AMS.

Vi använde oss även av INS-1 celler för att undersöka om agonister mot 5-HT-receptorerna 2a och 2b kan vara skadliga för β-cellerna. När INS-1 celler stimulerades med TCB-2, en agonist mot 5-HT-receptor 2a, i kombination med höga halter av socker och fett dog cellerna i större utsträckning. När INS-1 cellerna stimulerades med AMS, som riktar sig mot 5-HT-receptor 2b, i kombination med fett minskade antalet döda celler jämfört med betingelser med hög celldöd som orsakades av höga koncentrationer av fett.

Denna studie påvisade fördelaktiga effekter av aktivering av 5-HT-receptor 2 vid insulinutsöndring och β-cellers livsduglighet. Dessutom, i samband med AMS behandling så förbättrades insulinkänslighet vid en högkaloridiet. Studien visade att 5-HT-receptor 2b har en viktig roll i reglering av sockerbalansen.

Konklusion

Denna avhandling bidrar till ökad kunskap om hur serotonin och dess receptorer reglerar frisättningen av insulin och glukagon. Stora delar av avhandlingen bygger på studier av humant material men även på Langerhanska öar från möss och β-cellinjer har använts. Även om det finns stora skillnader mellan humana Langerhanska öar och öar från djurmodeller såsom mus är det viktigt att använda sig av dessa modeller. Det kan ge mer kunskap om öarnas respektive cellernas mekanismer och på det sättet ge större förståelse för hur insulinutsöndringen fungerar samt hur den kan påverkas. I tidigare studier har det visats att 5-HT minskar insulinutsöndringen i mus och råtta men här har vi visat att det även kan minska insulinfrisättningen i människa. I framtiden hoppas vi att den nya kunskap som denna avhandling bidragit med skall kunna leda till utveckling av nya läkemedel mot diabetes.

• author: Bennet, Hedvig
• supervisor: Malin Fex; Nils Wierup
• opponent: Professor Birnir, Bryndis, Uppsala University
• organization: Celiac Disease and Diabetes Unit (research group); EXODIAB: Excellence of Diabetes Research in Sweden
• publishing date: 2016
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cell and Molecular Biology
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2016:11
• pages: 78 pages
• defense location: Jubileumsaulan, MFC, Jan Waldenströms gata 5, Skånes Universitetssjukhus i Malmö.
• defense date: 2016-02-05 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-7619-237-5
• language: English
• LU publication?: yes
• id: a1e8cba3-f439-491a-8f03-ea19ed4665d0 (old id 8518276)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:47:27
• date last changed: 2019-05-22 01:35:10