Fatty Acyl Reductases and Fatty Acyl Desaturases. Deciphering the biosynthesis of species-specific moth female sex pheromones from common fatty acids

Abstract

Moths (Lepidoptera) are dependent on female produced pheromones, chemical signals, for attracting a mate. Pheromones are most commonly made up by saturated and/or unsaturated fatty acid derived alcohols, acetates, and/or aldehydes that are produced by a set of enzymes in the female pheromone gland. The enzymes involved are fatty acyl desaturases, pheromone gland fatty acyl reductases (pgFAR), β-oxidases, acetyl transferases, and alcohol oxidases. Among these, the desaturases and the pgFARs are the only genes have been identified and characterized. The desaturases introduce a double bond into the fatty acyl carbon chain, and the pgFARs catalyze the reduction from a fatty acyl CoA precursor to the corresponding alcohol. I have worked with these two enzymes, focusing on understanding their role in the biosynthetic pathway of moths and to understand how they shape a set of rather common fatty acyl precursors to a highly species specific pheromone. A single FAR-like gene, FARII, was found expressed in the pheromone gland only in three Yponomeutids, in contrast to other potential FARs that were expressed in the fat body as well. A functional assay revealed a broad activity of FARII on substrates between C12 and C16, which included all the pheromone precursors in the three species. A phylogenetic analysis of different FARs showed that all pgFARs belonged to a Lepidoptera-specific clade. The pgFARs from four Heliothinae species were then identified and functionally characterized. The enzymes reduced a broad set of precursors between C8 and C16. A comparison between the pheromone gland precursor ratio and pheromone component ratio indicated that there was a modulating step occurring between these. Adding three of the most common fatty acid precursors in defined ratios to the enzymes, elucidated that the pgFARs had a hierarchical selectivity, preferring Z9-14:ME over Z11-16:ME that in turn was preferred over Z9-16:ME. This confirmed that pgFAR has a shaping role in the pheromone biosynthesis in these species. A new phylogenetic tree, also including other arthropod and mammalian homologs known to perform similar reductive activities, again supported the pgFAR clade. Then the subcellular localization of pgFAR from Heliothis virescens (HvFAR) was studied by constructing fusion proteins between HvFAR and Green Fluorescent Protein (GFP) and expressing it in yeast. The C-terminally tagged protein localized to the endoplasmic reticulum (ER) where it retained its catalytic properties, as a contrast to the N-terminally tagged protein that was expressed in the cytoplasm with no enzymatic activity present. This indicates that the N-terminal is important for both subcellular localization and enzyme functionality, which was also supported by a series of truncations. HvFAR topology was investigated with a Fluorescent Protease Protection (FPP) assay, which showed that the C-terminal is located on the cytoplasmic side of the ER membrane. Together with a series in silico topology predictions, this led to a model of the pgFARs where the active site of the enzyme is placed on the cytoplasmic side of the ER membrane. Since this is also the case for the desaturase, this suggests that the ER is an important site in the moth pheromone biosynthesis. A pgFAR and a desaturase from the turnip moth, Agrotis segetum, were then functionally characterized. Two types of constructs were made for co-expression of both enzymes in yeast, and both methods successfully produced Z11-16:OH, which neither the yeast nor each enzyme alone can produce. Oxidized yeast extracts used on male H. virescens antennae by gas chromatography with electroantennographic detection (GC-EAD) verified biological activity of the products. There was no response on any other yeast component, which supports the use of yeast as a cell factory. Finally, two orthologous desaturases from the tortricids Ctenopseustis obliquana and C. herana were studied. Both were found in each species’ pheromone gland transcriptome and shared 97% sequence identity, but were quite different from other known moth desaturases sharing only 57% with the closest homolog from a butterfly. A phylogenetic analysis confirmed that the Ctenopseustis spp. desaturases clustered in a group of their own, which was more close to desaturases of unknown function in other insects rather than those involved in moth pheromone biosynthesis. A functional assay revealed that the desaturase was active on and selective on myristic acid, producing Z5-14:ME, a pheromone intermediate in both C. obliquana and C. herana, which confirmed the enzyme’s involvement in the pheromone biosynthesis. These results have together demonstrated the important interplay between the enzymes and the precursor ratios as well as between the enzymes themselves. The results have also elucidated the diversity of pgFARs and desaturases in Lepidoptera, and this knowledge has in turn been used to produce pheromone components in yeast.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

För över 100 år sedan upptäckte den franske naturalisten Jean-Henri Fabre att en nattfjärilshona som han hade på sitt skrivbord lyckades attrahera åtskilliga hanar, trots att honan var gömd bakom ett skynke och hannarna således inte kunde se henne. Fabre gissade att det var någon för honom okänd doft som låg bakom mysteriet. I slutet av 1950-talet identifierades det första feromonet, bombykol, en långkedjad alkohol från silkesfjärilen Bombyx mori som orsakade den av Fabre observerade doftattraktionen. Efter detta upptäcktes allt fler insektsferomon, och det blev alltmer uppenbart att insekter kan kommunicera med varandra med hjälp av olika typer av kemiska signaler. Ett feromon definieras som ett ämne som utsöndras av en individ inom en art och som känns igen av en annan individ inom samma art som i sin tur förändrar sitt beteende som svar på feromonet. Nattfjärilshonor producerar ett könsferomon i en specialiserad körtel, och feromonet utsöndras vid en viss tid på dygnet, varpå hannarna lokaliserar doftspåret och hittar till honan. Till skillnad från dagfjärilar så är nattfjärilar helt och hållet beroende av feromon för att kunna para sig, och eftersom nattfjärilar tillhör en av de mest artrika grenarna på livets träd så är feromonsystemet därför intressant att undersöka för att förstå hur arter bildas och evolverar.



Den vanligaste typen av ett nattfjärilsferomon är en artspecifik blandning av mättade och omättade fettsyror som har derivatiserats med en alkohol, aldehyd eller acetat som funktionell grupp. Hannarna är väldigt känsliga för kombinationen av kemiska ingredienser, dvs. varje art använder en specifik blandning av ämnen i specifika mängder. Om det sker en förändring av feromonet, exempelvis genom att en ingrediens ändras i förhållande till övriga kommer hannarna inte längre att svara på det och parning uteblir. Feromonerna biosyntetiseras, dvs. bildas från vanliga fettsyror som palmitinsyra och stearinsyra som finns i de flesta organismer. I feromonkörteln hos nattfjärilar finns en kombination av unika enzymer (proteiner med egenskaper som gör att de kan katalysera, dvs. öka hastigheten på kemiska reaktioner) uttryckta som tillsammans kan producera väldigt speciella fettsyrederivat som ingår i feromonet. Mitt avhandlingsarbete fokuserar på att identifiera gener som kodar för dessa enzymer, undersöka om de uppvisar någon aktivitet på ämnen som är föregångare till feromonet, och på så sätt länka samman de olika delarna i feromonbiosyntesen. Ett viktigt enzym är fettsyrareduktas (FAR) som katalyserar reaktionen från fettsyrans funktionella grupp till motsvarande alkohol. FAR återfinns hos de flesta svamp- och djurorganismer och har en grundläggande roll i metabolismen. Hos nattfjärilar finns ytterligare en grupp FAR: feromonbiosyntetiska FAR (pgFAR), som inte är aktiv på samma substrat som metaboliska FAR trots att de är homologer (evolutionärt besläktade). Studie I fokuserar på pgFAR från tre närbesläktade arter av spinnmalar, Yponomeuta spp. vars feromon består av olika kombinationer av omättade och mättade acetat- eller alkoholderivatiserade fettsyror. Degenererade primers är små DNA-fragment som är designade för att hitta så många olika men närbesläktade gener som möjligt. Dessa används för att ”fiska” fram sekvenser ur en heterogen blandning av DNA, som exempelvis ett transkriptom (alla uttryckta gener i en cell). Med hjälp av denna metod hittades tre FAR-lika sekvenser i spinnmalarnas feromonkörtel. Det var dock endast ett av dessa FAR som var aktivt i alla tre spinnmalsarter. Jäst innehåller alla nödvändiga celldelar för att enzymet ska kunna fungera. Genom att uttrycka genen i jäst i laboratoriet tillsammans med olika substrat blev det uppenbart att pgFAR uppvisade en bred aktivitet på fettsyror som består av kolkedjor som är mellan 12 och 16 kol långa . Detta inkluderar alla ämnen som är föregångare till det slutliga feromonet. pgFAR visade sig tillhöra en egen fjärilsspecifik subgrupp som är evolutionärt skild från metaboliska FAR. Enzymet är uttryckt specifikt i honans feromonkörtel, men inte i övriga insektskroppen, från det att hon kläckts men uttrycks desto mer efter någon dag. Dessutom finns det en skillnad i vilken mängd som generna uttrycks under honans dygnsrytm vilket visar sig genom att pgFAR är som mest aktivt precis innan det blir ljust. Detta är i sin tur precis innan den tid på dygnet då feromonet utsöndras.



I studie II fortsätter analysen av pgFAR för att förstå dess roll i feromonbiosyntesen, men denna gång används fyra närbesläktade noctuider, Heliothinae. Det skiljer endast några få aminosyror mellan proteinsekvenserna hos de fyra homologerna som hittats, vilka i sin tur är en pgFAR för varje art, och de tillhör samma grupp som spinnmalarnas pgFAR på det evolutionära trädet. Ytterligare en likhet med föregående studie är att även dessa enzymer uppvisar aktivitet på många olika substrat, till och med ned till 8 kol långa fettsyror. De fyra noctuiderna har alla ett feromon som består av olika sammansättningar av snarlika aldehyder. När förhållandet mellan aldehyderna jämfördes med feromonkörtelns sammansättningar av de fettsyror som är deras föregångare blev det uppenbart att pgFAR borde ha någon slags formande roll i biosyntesen. För att undersöka denna hypotes användes återigen jäst för att producera varje enzym. Istället för att tillsätta ett substrat per försök testades en jämn blandning av de tre mest typiska fettsyrorna som är föregångare till feromonet: (Z)-9-tetradekensyra-metylester (Z9-14:ME), (Z)-9-hexadekensyra-metylester (Z9-16:ME) samt (Z)-11-hexadekensyra-metylester (Z11-16:ME). Resultatet visade att pgFAR starkt föredrog Z9-14:ME över Z11-16:ME, som i sin tur föredrogs över Z9-16:ME. Detta fick en stark effekt på produktsammansättningen när blandningen av fettsyror gjordes ojämn i ett försök att efterlikna situationen i feromonkörteln. Det visade sig även att det fanns små skillnader mellan de fyra pgFAR som blev mer uppenbara när substratförhållandena varierades. Studien visade därmed att pgFAR har en plastisk roll i dessa arters feromonbiosyntes trots att de uppvisar en bred aktivitet överlag.



En cell är inte en homogen miljö och för att kunna förstå en biosyntesväg samt de involverade enzymerna så är det viktigt att analysera deras subcellulära lokalisering (var i cellen de finns). I detta syfte satte studie III vidare fokus på pgFAR genom att sätta samman genen som kodar för enzymet med en gen för ett grönt fluorescerande protein (GFP). När pgFAR uttrycks i jästcellen kan man med hjälp av fluorescensmiskroskopi se var det befinner sig tack vare att GFP, som lyser vid en viss våglängd, sitter samman med enzymet. Analysen visade att pgFAR finns i en specifik organell (intracellulär struktur), det endoplasmatiska nätverket (ER). Man vet sedan tidigare att fettsyradesaturas (här: desaturas), en enzymgrupp som också är involverade i feromonbiosyntesen finns i samma organell. ER-lokaliseringen var uppenbar när GFP satt samman med C-terminalen (proteinets ”slut”) av pgFAR, och då var även enzymaktiviteten intakt. När GFP sattes i N-terminalen (proteinets ”början”), så upphörde enzymaktiviteten och GFP-signalen hittades istället i cellens cytoplasma. Detta tydde på att något i N-terminalen var viktigt för att pgFAR skulle hamna rätt i cellen och för att det skulle vara ett aktivt enzym. Ett vanligt sätt för ett protein att hamna i ER är via korta signaler i aminosyrasekvensen. Ingen sådan kunde hittas och det var därför oklart hur pgFAR hamnade i organellen. För att ringa in viktiga delar skapades och studerades trunkerade (ett protein som saknar vissa delar) versioner av pgFAR, där intressanta delar hade avlägsnats. Alla trunkeringar påverkade pgFAR så att enzymaktiviteten upphörde och genom att ER-lokaliseringen försvann eller, som i ett av fallen, blev mindre uppenbar. Följden av trunkeringen av N-terminalen var mer dramatisk än motsvarande av C-terminalen, vilket återigen pekade på att förstnämnd del var mycket viktig för pgFARs subcellulära lokalisering. Med hjälp av diverse datorbaserade program förutspåddes det att pgFAR skulle ha tre transmembrana domäner (delar av ett protein som tenderar till att befinna sig i membran) som fick enzymet att sitta i ER-membranet. Ytterligare ett experiment gjordes för att undersöka på vilken sida av membranet som C-terminalen befann sig. Först tillsattes digitonin som selektivt öppnar upp porer i cellens membran, dock utan att påverka ER-membranet. Detta gör att alla lösliga proteiner i cytoplasman diffuserar ut ur cellen. En jästkontroll med enbart lösligt GFP användes för att visa att dess signal försvann i detta steg, medan signalen från GFP som satt samman med pgFAR inte påverkades. I nästa steg tillsattes ett proteas (enzym som bryter ned proteiner) som tack vare digitonin kunde ta sig in i cellen och bryta ned alla tillgängliga proteiner, exempelvis de som satt på ER-membranets utsida. Redan i detta steg försvann GFP-signalen, vilket tydde på att pgFAR C-terminalen befann sig på ER-membranets cytoplasmiska sida. Om signalen hade varit intakt hade det tytt på att situationen var det omvända. Med hjälp av dessa resultat i kombination med allmän kunskap om FAR kunde en hypotetisk modell av pgFAR byggas upp, där enzymets aktiva del befann sig på den cytoplasmiska delen av ER-membranet. Detta överensstämmer återigen med situationen för desaturaserna, och är två viktiga delar i förståelsen hur feromonbiosyntesen är uppbyggd inuti en cell.



Tack vare att nattfjärilar är helt och hållet beroende av kemiska signaler för reproduktion så kan man använda feromoner för att kontrollera skadeinsekter. Förutom att förhindra att insekterna hittar varandra, vilket kan minska angrepp från hungriga larver avsevärt, så är feromonfällor ett mer miljövänligt alternativ än konventionella bekämpningsmedel. Som tidigare nämnt är ett feromon artspecifikt så istället för att döda alla insekter, inkluderat de som inte gör någon skada och är viktiga delar av ekosystemet, så fokuserar feromonfällor enbart på de arter som gör skada. Att framställa fermoner innebär att man måste isolera en stor mängd material och kemiskt modifiera dessa för att få de rätta slutprodukterna. Beroende på hur komplicerat feromonet är kan detta innebära större eller mindre svårigheter med miljöfarliga reagenser och en stor mängd kemiskt avfall. Eftersom nattfjärilarna själva kan skapa dessa ämnen från ett väldigt enkelt ursprungsmaterial, borde inte vi kunna lära oss att använda deras biosyntes i samma syfte? Studie IV är ett försök att göra just det genom att använda två enzym från feromonbiosyntesen hos sädesbroddfly. I ett första steg studerades varje enzym för sig: ett desaturas som desaturerar (sätter in dubbelbindningar) vid kol 11, på 12 till 16 kol långa fettsyror, samt ett pgFAR som var snarlikt de tidigare nämnda spinnmals- och noctuidenzymerna. Båda generna fördes sedan in i jäst för att kunna uttryckas parallellt. Jäst producerar normalt en större mängd fettsyror som kan fungera som substrat för både desaturaset och pgFAR. När båda generna uttrycktes hittades en stor mängd alkoholer som följd av pgFARs aktivitet. En produkt, (Z)-11-hexadekanol (Z11-16:OH) kunde dock omöjligen ha producerats av enbart jäst, eller enbart ett av nattfjärilsenzymerna, och resultatet visade att båda gener var aktiva. Precis som i insektscellen så hade desaturaset använt palmitinsyra som substrat, och producerat (Z)-11-hexadekansyra, som i sin tur blev substrat för pgFAR som producerade Z11-16:OH. I syfte att undersöka om extraktet från jäst var fritt från ämnen som kunde störa nattfjärilshanar så användes metoden GC-EAD (gaskromatografiskt elektroantenndendrogram) där en antenn kopplas till en elektrod som i sin tur är kopplad till en dator som registrerar alla signaler från antennen. Datorn är även kopplad till en gaskromatograf (GC) där man injicerar sitt prov. I en GC separeras komponenterna i provet enligt storlek och andra kemiska egenskaper innan de når en detektor. I en GC-EAD delas provet upp precis innan så att en liten del även skickas till antennen. På så sätt kan man korrelera signalerna från antennen med data från detektorn. Detta gjordes med oxiderat jästextrakt där de två nattfjärilsenzymerna varit aktiva, mot en antenn från en annan noctuidhane. Som förväntat registrerade antennen alla de producerade feromonkomponenterna. Antennen registrerade inte något alls från den negativa kontrollen (endast jäst) vilket styrkte idén om att använda jäst som en cellfabrik för produktion av nattfjärilsferomonkomponenter.



Studie V fokuserade på ett desaturas hos två systerarter av tortricider från Nya Zealand. Tidigare studier har visat att (Z)-5-tetradecenylacetat (Z5-14:OAc), som är en väsentlig del av bägge arternas feromon, skapas genom en desaturering av tetradekansyra vid kol 5. Hitintills har dock ingen gen eller enzym hittats som kan förklara detta steg i biosyntesen. I ett transkriptom från feromonkörteln hittades nu ett desaturas uppreglerat (genen uttrycks i fler kopior jämfört med i övrig vävnad). Den translaterade aminosyrasekvensen skiljde sig avsevärt från tidigare karakteriserade desaturas hos nattfjärilar och evolutionärt verkade enzymet vara mer besläktat med desaturas från andra insekter. När genen uttrycktes i jäst producerades enbart (Z)-5-tetradekensyra vilket tydde på att enzymet var selektivt för tetradekansyra och enbart kunde göra Z5-desatureringar. Studien knyter samman den ursprungliga teorin om hur de två tortriciderna biosyntetiserar Z5-14:OAc med funktionell data, men visar även att variansen av desaturaser hos nattfjärilar både är större och förmodligen äldre än vad man tidigare har trott.



Sammanfattningsvis visar resultaten av min avhandling att feromonbiosyntesen är ett samspel mellan uttrycket av de involverade generna och förhållandet mellan de fettsyror som är föregångare till feromonet. Resultaten visar även att ER är en viktig subcellulär plats för några av biosyntesens viktigaste enzymatiska reaktioner. Till sist har denna kunskap använts för att utarbeta en metod som gör det möjligt att producera delar av ett feromon i ett ”jästbryggeri”.

• author: Hagström, Åsa
• supervisor: Christer Löfstedt
• opponent: Professor Ruther, Joachim, The University of Regensburg
• organization: Department of Biology; Pheromone Group (research group)
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Moth, pheromone, insect, evolution, fatty acyl desaturase, fatty acyl reductase, endoplasmic reticulum, fatty acid biosynthesis, GFP, heterologous expression, phylogeny, cell factory, lepidoptera
• pages: 132 pages
• defense location: Blue Hall, Ecology building, Sölvegatan 37, 223 62 Lund
• defense date: 2013-05-24 09:30:00
• ISBN: 978-91-7473-467-6
• project: The pheromone brewery
• project: Evolutionary mechanisms of pheromone divergence in Lepidoptera
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 98144058-ed3a-434c-8a3c-aa00dfa3cbea (old id 3706305)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:35:00
• date last changed: 2020-09-23 15:07:01