Advanced

The interconnected KIT receptor and Microphthalmia-associated transcription factor axis in melanoma

Phung, Bengt LU (2013) In Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series 2013:82.
Abstract
Melanoma is an aggressive disease that arises from deregulated signaling events in melanocytes. The KIT receptor tyrosine kinase and the Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) are two essential components that are required for the normal physiology of melanocyte development and function. Consequently, aberrant activities of these factors are involved in the development of melanoma. To better

understand the molecular basis of disease development we studied the mechanisms that gatekeep and finetune the activity of both KIT and MITF.



In this thesis we have identified novel KIT ligand-dependent signaling pathways that, through MITF, affect cell proliferation. Notably, we found that the specific KIT... (More)
Melanoma is an aggressive disease that arises from deregulated signaling events in melanocytes. The KIT receptor tyrosine kinase and the Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) are two essential components that are required for the normal physiology of melanocyte development and function. Consequently, aberrant activities of these factors are involved in the development of melanoma. To better

understand the molecular basis of disease development we studied the mechanisms that gatekeep and finetune the activity of both KIT and MITF.



In this thesis we have identified novel KIT ligand-dependent signaling pathways that, through MITF, affect cell proliferation. Notably, we found that the specific KIT tyrosine phosphorylation sites Y721 (PI3 kinase binding site), Y568 and Y570 (SRC binding sites) affect phosphorylation status of the MITF protein. Using

inhibitors against SRC, PI3K, AKT, MEK ERK and p38 during KIT activation, we identified that these signaling pathways are essential components in communicating signals between KIT and MITF.



The activity of KIT is regulated by the tetrapeptide insert in the extracellular juxtamembrane domain of the

receptor. By generating receptor mutants with different insert lengths, we showed that the length of this insert is critical for the fine tuning of receptor activation.



Using mass spectrometry and phospho-site specific antibodies against MITF, we found and characterized several serine and tyrosine phosphorylation sites in the protein. More importantly, in stark contrast to previous results, we discovered that the S73 and S409 phosphorylation sites of MITF are neither dependent

on KIT nor MAPK-ERK signaling. Furthermore, we show that the tyrosine phosphorylation sites of MITF are required for oncogenic KIT signaling and affect nuclear localization of MITF.



The structural properties of MITF and the KIT receptor were also clarified. By solving the crystal structure of MITF we explain the restricted heterodimerization of MITF towards TFEB, TFEC and TFE3, the binding of M-box DNA sequence and the ability to produce interallelic complementation.



In short, the detailing of KIT and MITF regulation has increased our understanding of key signaling

processes that are important to understand the development of melanoma. (Less)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Den farligaste formen av hudcancer, melanom, uppkommer genom okontrollerad tillväxt av melanocyter som är celler specialiserade i pigmentproduktion. Dessa celler skyddar oss från den farliga UV-strålingen med hjälp av pigment som omvandlar ljusvågor till värme. I Sverige drabbas drygt 2000 personer per år av sjukdomen. Cirka 80-85 % av dessa botas genom kirurgi men hos 15-20 % av patienterna har cancern spridit sig till andra organ vilket gör att överlevnadschansen drastiskt sjunker till 7-19 %. I denna avhandling utforskas den cellulära kommunikationen i melanocyter. Genom att förstå de molekylära mekanismerna, bland annat cellkommunikation och cellsignalering, bakom sjukdomsförloppet av... (More)
Popular Abstract in Swedish

Den farligaste formen av hudcancer, melanom, uppkommer genom okontrollerad tillväxt av melanocyter som är celler specialiserade i pigmentproduktion. Dessa celler skyddar oss från den farliga UV-strålingen med hjälp av pigment som omvandlar ljusvågor till värme. I Sverige drabbas drygt 2000 personer per år av sjukdomen. Cirka 80-85 % av dessa botas genom kirurgi men hos 15-20 % av patienterna har cancern spridit sig till andra organ vilket gör att överlevnadschansen drastiskt sjunker till 7-19 %. I denna avhandling utforskas den cellulära kommunikationen i melanocyter. Genom att förstå de molekylära mekanismerna, bland annat cellkommunikation och cellsignalering, bakom sjukdomsförloppet av melanom, kan vår utökade kunskap leda till utveckling av förbättrade läkemedel mot sjukdomen.



Cellsignalering är de processer som påverkar cellernas beteende. Till

exempel kan en cell ta emot signaler från sin omgivning och startar signalfortledning (signaltransduktion) bestående av flera proteinnätverk. Genom dessa signaleringsvägar omvandlas signalerna från cellens utsida till cellulära svar med hjälp av så kallade transkriptions-faktorer som reglerar vilka gener som ska vara påslagna. Ett ökat eller minskat uttryck av vissa gener kan påverka celldelning, programmerad celldöd, tillväxt eller metabolism.



Ett annat viktigt koncept inom cellsignalering är fosforylering av proteiner. Fosforylering är en biokemisk reaktion där proteinkinaser hjälper till att fästa en eller flera fosfatgrupper på ett protein. Fosforyleringen påverkar proteinet så att dess aktivitet antingen slås på eller stängs av, hur det kan interagera med andra proteiner eller dess stabilitet.



KIT är en tillväxtfaktor-receptor som skickar signaler från utsidan till

insidan av en cell. Ett av proteinerna som påverkas av signaler från KIT är

transkriptions-faktorn MITF. Dessa proteiner spelar central roll i utvecklingen och funktionen hos melanocyter. Störningar i signaleringen mellan KIT och MITF och/ eller mutationer i dessa proteiner är ett vanligt förekommande fenomen i hudcancer. För att få djupare insikt i hur KIT och MITF kan påverka melanocyternas och melanoms utveckling och funktion har vi i denna avhandling undersökt KIT och MITF med avseende på proteinstruktur, signaleringsvägar och fosforylering.



I det första arbetet undersökte vi hur proteinstrukturen hos KIT reglerar receptorsignalering. Vi tillverkade KIT proteiner med olika längder på den del av receptorn som ligger alldeles utanför cell-membranet. Vi visade att det var just längden i den regionen som påverkade KIT fosforyleringens intensitet. Graden av receptorfosforylering in sin tur påverkade melanomcellers överlevnad i närvaro av cellgifter.



I det andra arbetet kunde vi med hjälp av farmakologiska hämmare och strategiskt framkallade mutationer i KIT identifiera flera nya signaleringsvägar mellan KIT och MITF. Dessa signaleringsvägar visade sig vara viktiga för hur KIT reglerar celldelning.



I det tredje arbetet analyserade vi MITFs tredimensionella struktur genom att använda röntgenkristallografi. Strukturen vi kom fram till medförde en ökad kunskap om hur MITF selektivt binder till andra transkriptionsfaktorer och DNA och förklarade hur vissa mutationer i MITF hämmar dess funktion mer än andra beträffande utvecklingen av melanocyter.



I det fjärde och femte arbetet använde vi en molekylär metod som kallas för masspektrometri för att exakt identifierat var i MITF som fosfat binder. Tillsammans med egentillverkade antikroppar som är designade mot dessa fosforylerade platser upptäckte vi flera tidigare okända fosforyleringsmodifieringar på MITF. Hittills har dessa modifieringar visats sig vara viktiga för bland annat lokalisering av MITF till en specifik plats i cellen och reglering av genuttryck.



Sammanfattningsvis har avhandlingen bidragit med förbättrad kännedom om signaleringsvägar mellan, och strukturs- och fosforyleringsförändringar av KIT och MITF som är väsentliga för den biologiska regleringen av melanocyter och melanomceller. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Professor Östman, Arne, karolinska institutet
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
in
Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
volume
2013:82
pages
93 pages
publisher
Experimental Clinical Chemistry
defense location
Clinical Research Centre lecture hall, Malmö
defense date
2013-09-06 13:15:00
ISSN
1652-8220
ISBN
978-91-87449-54-3
language
English
LU publication?
yes
additional info
The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Experimental Clinical Chemistry (013016010)
id
a3fce380-8659-42c2-bf38-4926730d11bf (old id 3971191)
date added to LUP
2016-04-01 13:40:00
date last changed
2019-05-22 04:36:41
@phdthesis{a3fce380-8659-42c2-bf38-4926730d11bf,
  abstract     = {Melanoma is an aggressive disease that arises from deregulated signaling events in melanocytes. The KIT receptor tyrosine kinase and the Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) are two essential components that are required for the normal physiology of melanocyte development and function. Consequently, aberrant activities of these factors are involved in the development of melanoma. To better<br/><br>
understand the molecular basis of disease development we studied the mechanisms that gatekeep and finetune the activity of both KIT and MITF.<br/><br>
<br/><br>
In this thesis we have identified novel KIT ligand-dependent signaling pathways that, through MITF, affect cell proliferation. Notably, we found that the specific KIT tyrosine phosphorylation sites Y721 (PI3 kinase binding site), Y568 and Y570 (SRC binding sites) affect phosphorylation status of the MITF protein. Using<br/><br>
inhibitors against SRC, PI3K, AKT, MEK ERK and p38 during KIT activation, we identified that these signaling pathways are essential components in communicating signals between KIT and MITF.<br/><br>
<br/><br>
The activity of KIT is regulated by the tetrapeptide insert in the extracellular juxtamembrane domain of the<br/><br>
receptor. By generating receptor mutants with different insert lengths, we showed that the length of this insert is critical for the fine tuning of receptor activation.<br/><br>
<br/><br>
Using mass spectrometry and phospho-site specific antibodies against MITF, we found and characterized several serine and tyrosine phosphorylation sites in the protein. More importantly, in stark contrast to previous results, we discovered that the S73 and S409 phosphorylation sites of MITF are neither dependent<br/><br>
on KIT nor MAPK-ERK signaling. Furthermore, we show that the tyrosine phosphorylation sites of MITF are required for oncogenic KIT signaling and affect nuclear localization of MITF.<br/><br>
<br/><br>
The structural properties of MITF and the KIT receptor were also clarified. By solving the crystal structure of MITF we explain the restricted heterodimerization of MITF towards TFEB, TFEC and TFE3, the binding of M-box DNA sequence and the ability to produce interallelic complementation.<br/><br>
<br/><br>
In short, the detailing of KIT and MITF regulation has increased our understanding of key signaling<br/><br>
processes that are important to understand the development of melanoma.},
  author       = {Phung, Bengt},
  isbn         = {978-91-87449-54-3},
  issn         = {1652-8220},
  language     = {eng},
  publisher    = {Experimental Clinical Chemistry},
  school       = {Lund University},
  series       = {Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series},
  title        = {The interconnected KIT receptor and Microphthalmia-associated transcription factor axis in melanoma},
  volume       = {2013:82},
  year         = {2013},
}