The digestive machinery of a human gut bacterium : Structural enzymology of galactomannan utilisation

Abstract

Human gut bacteria utilise different types of polysaccharides present in our diet. One of these polysaccharides is galactomannan. Many organisms in the phylum Bacteroidetes have gene clusters encoding for all proteins required for hydrolysis, binding and transport of one type of polysaccharide, called polysaccharide utilisation loci (PULs). A PUL from the human gut bacterium Bacteroides ovatus was previously indicated to be involved in galactomannan utilisation (BoManPUL) and codes for one glycosde hydrolase (GH) family 36 α-galactosidase (BoGal36A, Paper I) and two GH26 β-mannanases (BoMan26A and BoMan26B, Papers II-IV).
In Paper I B. ovatus was shown to be able to grow on galactomannan, an ability which was lost upon knockout of BoManPUL, indicating that it was primarily responsible for galactomanna utilisation in this human gut bacteria. Papers I-III revealed a pathway for galactomanna utilisation in which BoMan26B initially cleaves polysaccharide substrates outside the cell, the products of which are transported into the periplasm and there further processed by BoGal36A, then BoMan26A.
BoMan26B is outer membrane attached, preferntially hydrolyses longer substrates (Paper II) and is one of the enzymes in GH26 least restricted by galactose substitutions (Papers II and III). Crystal structures revealed a long, open active site cleft, only being restricted by galactose substitutions in one subsite -2 and possibly favouring a substitution in subsite -4 (Paper III). BoMan26B provides sequential synergy to BoGal36A (Paper III), which preferentially hydrolyses internal galactose substitutions from galactomanno-oligosaccharides (Paper I). This hydrolysis of internal galactosyl units is unusual in GH36, which was shown to be caused by the absence of a loop that is present in other GH36 subgroup I members (Paper I). BoGal36A in turn provides sequential synergy to the endo-capable mannobiohydrolase BoMan26A, which preferentially cleaves unsubstituted mannooligosaccharides (Paper II). The structure of BoMan26A revealed a narrow active site cleft where at least two subsites are restricted by galactose substitutions, and which was blocked beyond subsite -2 by two loops: 2 and 8 (Paper II). NMR assignment of the BoMan26A backbone was carried out in Paper IV, to perform further NMR-based studies of substarte binding and protein dynamics relating to loops 2 and 8.
BoMan26A and BoMan26B differ both in structure and biochemistry and in a phylogenetic analysis of selected GH26 sequences they were shown to cluster in different branches (Paper III). The level of conservation around the active site cleft was generally low, with the exceptions of the -1 and +1 subsites (Paper III).
This thesis reveals a model for galactomannan PUL utilisation in B. ovatus, increasing the understanding of our gut microbiota. It also delves into the structure-function relationship of substrate specificity in, primarily, GH26 enzymes.

Abstract (Swedish)

Vi kryllar av bakterier. De bor framför allt i vår tjocktarm där de lever på de delar av vår mat som vi inte kan ta hand om själva. I utbyte omvandlar bakterierna en del av maten de äter till vitaminer och fettsyror som är viktiga för oss. Det bor flera olika arter av bakterier i vår tarm som äter lite olika saker, eftersom det är ont om mat för så många har de flesta specialiserat sig för att minska konkurrensen.
Våra tarmbakterier är viktiga för vår hälsa. Förutom att påverka relativt uppenbara saker som en irriterad tarm eller övervikt, har de också en inverkan på så skilda saker som immunförsvaret och blodtrycket. Eftersom vår tarmflora är så viktig och lever på det vi äter vill man förstå exakt vad olika arter äter för att kunna påverka vår tarmflora i en positiv riktning genom kosten. En del av det som finns i maten som bakterierna får tillgång till är kolhydrater vilket är olika sorters socker, som när de sitter ihop i långa kedjor kallas polysackarider. De mest välkända polysackariderna är nog cellulosa, som bland annat används i papperstillverkning, och stärkelse: en självklar del av vår kost. Stärkelse är den enda polysackarid i vår mat som vi kan bryta ner själva, men vi äter många olika sorters polysackarider dagligen. Det finns väldigt många andra typer av polysackarider, främst i växter, som består av ett stort antal olika socker, så kallad hemicellulosa. Hemicellulosa är en typ av kostfiber och är en av källorna till mat för våra tarmbakterier.
En sorts hemicellulosa heter galaktomannan och består av långa kedjor av sockret mannos med sockret galaktos som sticker ut från denna kedja. Galaktomannan finns i frön från vissa baljväxter, alltså i bönor och ärtor, och används som förtjockningsmedel i en del mat, till exempel glass. För att kunna bryta ner galaktomannan behövs enzymer. Enzymer är protein som tillverkas av alla levande celler. Enzymerna utför olika typer av reaktioner, till exempel att klippa sönder polysackarider eller bygga ihop DNA. För att kunna bryta ner galaktomannan behöver våra tarmbakterier framför allt två olika sorters enzymer: α-galaktosidas, som klipper bort galaktosen som sticker ut från mannoskedjan, samt β-mannanas som klipper sönder själva huvudkedjan.
En vanligt förekommande tarmbakterie som kan bryta ner galaktomannan heter Bacteroides ovatus. I denna bakterie, samt i många besläktade bakterier, finns det specifika delar av DNA som innehåller instruktionerna för alla proteiner som krävs för att bryta ner och använda en viss typ av polysackarid, som till exempel galaktomannan. Förutom enzymer finns i dessa DNA delar även proteiner som håller fast polysackariden vid cellytan samt proteiner som transporterar den sönderklippta sockerkedjan in i cellen. Det är enzymerna i denna DNA del som denna avhandling har fokuserat på: ett α-galaktosidas och två β-mannanas.
α-Galaktosidaset, som framför allt studerades i Artikel I, kunde ta bort upp till 90% av alla galaktos från galaktomannan. Detta var förvånande eftersom alla liknande enzym som man känner till bara kan ta bort galaktos som sitter i änden på en sockerkedja, medan detta enzym kunde ta bort galaktoser som stack ut mitt i kedjan. För att förstå hur detta var möjligt gjordes en modell av hur enzymet ser ut. Andra liknande enzymer har en lång loop som ligger precis bredvid den del av enzymet klipper galaktos. Denna loop var mycket kortare i α-galaktosidaset från Bacteroides ovatus, vilket gjorde att en längre sockerkedja fick plats.
I DNA-delen finns två β-mannanaser. Den ena, mannanas A, studerades i Artikel II och var mycket bra på att klippa sönder korta mannoskedjor, men hade svårt för att göra det om det satt galaktos på kedjan. Om mannanas A fick jobba ihop med α-galaktosidaset blev den betydligt effektivare. Mannoskedjorna blev framför allt nerklippta till mannobios, en molekyl som består av två mannossocker. Strukturen av mannanas A, alltså hur den såg ut, visade att enzymet formar en klyfta som en mannoskedja kan lägga sig i, men där galaktoser har svårt att få plats. Ena änden av klyftan blockeras av en loop som gör att bara två mannossocker får plats. Detta är förbryllande eftersom enzymet kan klippa ner galaktomannan till längre sockerkedjor än mannobios, även om den inte föredrar det. Artikel IV förbereder för en studie som ska ta reda på hur mannanas A rör på sig för att se om den blockerande loopen kan flytta på sig när enzymet binder sockerkedjor.
Det andra β-mannanaset, mannanas B, studerades i Artikel II och III och, till skillnad från mannanas A, klippte mannoskedjan lika bra oavsett om det fanns galaktos på den eller inte. Mannanas B hjälpte α-galaktosidaset att bli mer effektivt, men blev inte själv effektivare av att de jobbade ihop. Dessutom visade det sig att detta enzym sitter på utsidan av cellen, vilket de andra två inte gör. I Artikel III visade strukturen av mannans B att det också hade en klyfta, men att den var öppnare, för att får plats med galaktos, och längre, vilket gör att enzymet föredrar längre sockerkedjor.
Detta ger en bild av hur Bacteroides ovatus bryter ner galaktomannan: β-mannanas B klipper galaktomannan till kortare kedjor på utsidan av cellen. Dessa kortare kedjor transporteras in i cellen där α-galaktosidaset tar bort galaktosen varefter β-mannanas A klipper sönder resten till mannobios som kan användas för energiproduktion. Detta ökar förståelsen för hur en tarmbakterie bryter ner en typ av kostfiber, vilket bidrar till helhetsbilden för hur vår tarmflora fungerar. Förhoppningen är att, genom att ha en detaljerad helhetsbild av vår tarmflora, så småningom kunna utveckla dieter och kosttillskott för att hjälpa dem vars tarmflora är ur balans, till exempel på grund av antibiotika.

• author: Bågenholm, Viktoria
• supervisor: Henrik Stålbrand; Derek Logan
• opponent: Professor Leggio, Leila Lo, Kemisk Institut, Köpenhamns universitet
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2018-09
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Other Chemistry Topics
• keywords: beta-mannanase, Glycoside hydrolase, enzymology, structural biology, kinetics, HPLC, product profiles, structure-function
• pages: 196 pages
• defense location: Sal B, Kemicentrum, Naturvetarvägen 14, Lund
• defense date: 2018-10-19 13:15:00
• ISBN: 978-91-7422-605-8
• ISBN: 978-91-7422-595-2
• language: English
• LU publication?: yes
• id: b0bc40c5-5dbe-442d-9e20-25f87652d4ed
• date added to LUP: 2018-09-24 09:06:39
• date last changed: 2018-11-21 21:41:44