Studies on signaling pathways induced by FLT3, an important oncogene in AML

Abstract

FLT3, a receptor tyrosine kinase, is expressed in hematopoietic progenitor cells. FLT3-ITD (internal tandem duplication) and D835 mutations are found in approximately 30% and 7% of Acute Myeloid Leukemia (AML) patients respectively, and correlate with a poor prognosis, thus making the mutated receptor a potential therapeutic target. FLT3 mutations cause constitutive activation of intrinsic tyrosine kinase of the receptor, leading to ligand-independent signal transduction.

The aims of my studies have been to analyze the kinetics and specificity of FLT3 autophosphorylation in wild-type FLT3 and mutants, to identify novel phosphorylation sites in FLT3 receptor, to find out PTPs which can affect the signaling activity of FLT3, to investigate a novel class of tyrosine kinase inhibitors, 3, 4-diarylmaleimides for their ability to inhibit FLT3 and to determine the role of MEK5/ERK5 signaling in FLT3-ITD mediated transformation.

Using phosphospecific antibodies, we have identified 3 novel phosphorylation sites in FLT3, Y726, Y793 and Y842, and studied their kinetics and specificity. The additional eight phosphorylated tyrosine residues in FLT3 were shown to have different phosphorylation characteristics in the wild-type FLT3 compared to the mutated receptors. We have found that the protein tyrosine phosphatase DEP-1 serves as a negative regulator of FLT3 activation and signaling. Furthermore, 3,4-diarylmaleimides inhibitors have been found to be able to inhibit FLT3-ITD in both transfected cells as well as primary ITD-positive AML blasts leading to induction of apoptosis in those cells. These inhibitors also reduced the phosphorylation of signaling molecules downstream of FLT3-ITD such as ERK and STAT5. The last paper in the thesis revealed the anti-apoptotic effect of MEK5/ERK5 on FLT3-ITD expressing leukemia cells.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vår kropp består av olika celler som kommunicerar med varandra genom signalering. Cellerna tar emot signaler från omgivningen med hjälp av proteiner som sätter sig fast på deras yta genom mottagare, så kallade receptorer. När receptorerna får signaler skickas de vidare in i cellkärnan där det bestäms hur cellen ska agera. Tyrosinkinasreceptorer är proteiner som sitter på cellens yta och är involverade i många processer i celler, till exempel tillväxt, celldelning, mognad, metabolism, överlevnad och rörelseförmåga. Tyrosinkinasreceptorer brukar aktiveras av en typ av ligander som kallas tillväxtfaktorer. När liganden binder till en receptor leder detta till att receptorerna slås ihop två och två, vilket i syn tur leder till fosforylering- ett sätt att skicka signaler inom celler. FLT3 tillhör familjen tyrosinkinasreceptorer och uttrycks på omogna blodceller och har en viktig roll i nybildningen av blodceller, cellernas överlevnad och celldelning. Receptorn aktiveras av en tillväxtfaktor, FLT3 ligand (FL). Det finns flera sjukdomsalstrande former av FLT3 (mutation ITD och D835Y) som leder till ständig aktivering av FLT3 dvs. utan tillväxtfaktor-stimulering, vilket leder till förändringar i signalvägarna och kan bidra till akut myeloisk leukemi (blodcancer). Dessa förändringar förekommer hos cirka 30% av patienterna med akut myeloisk leukemi (AML) och korrelerar även till en sämre prognos. AML drabbar ungefär 360 personer per år i Sverige. AML är den vanligaste formen av leukemi hos vuxna och orsakar en onormalt stor produktion av omogna blodceller vilket orsakar sjukdom. Eftersom dessa mutationer är vanligt förekommande är det viktigt att studera den här receptorn för att försöka framställa läkemedel som fungerar hämmande endast mot receptorerna med dessa mutationer men inte mot normal FLT3 eller andra receptorer. Syftet med det första arbetet var att undersöka och jämföra fosforylering/aktivering av FLT3 receptorn i både normala celler och leukemiska celler. Vi har identifierat flera nya fosforyleringsställen på FLT3 receptorn med hjälp av hemgjorda fosfospecifika antikroppar. Vi jämförde aktiveringen av specifika tyrosiner mellan vildtypsreceptorn och respektive muterade receptorer. Studien har visat att det finns såväl kvalitativa som kvantitativa skillnader i hur receptorerna fosforyleras. Det visar sig att alla tyrosinerfosforylerades olika i de tre FLT3-varianterna. Med detta har vi visat att de muterande FLT3 har specifika signaleringsvägar som är olika från den normala s.k. vildtypsreceptorn. Det är en viktig information för att kunna skapa nya behandlingsmöjligheter för AML patienter. Det andra arbetet handlar om ett proteintyrosinfosfatas (PTP), DEP-1 och hur det kontrollerar FLT3 signaling. PTP är en grupp av enzymer som tar bort fosfatgrupper från fosforylerade tyrosiner på proteiner. Vi har identifierat ett enzym, DEP-1 och visat att det är involverat i negativ reglering på fosforylering och signalering genom FLT3. Vi har också visat att DEP-1 interagerar direkt med FLT3. Akut brist av DEP-1 i human cell linje med AML orsakar förhöjd fosforylering av såväl FLT3 som MAP-kinaset ERK. DEP-1 visade sig också öka cellernas tillväxt och överlevnad. Dessa data tyder på att DEP-1 kan negativt reglera FLT3s signareringsaktivitet och kan bidra till leukemogenisk celltransformation.

I det tredje arbetet undersökte vi 3,4-Diarylmaleimider, en typ av kinashämmare, som nedreglerar fosforyleringen av signaleringsmolekyler nedströms om Flt3 receptorn (t ex STAT5, AKT and ERK). Denna nya klass av hämmare framkallar celldöd (apoptos) i FLT3-ITD celler redan vid låg koncentration hämmare. Eftersom dessa hämmare är så effektiva mot FLT3-ITD skulle de i framtiden kunna användas i terapi för AML patienter i kombination med kemoterapi. Det unika med denna studie är att den visar inte bara hur generell fosforylering av FLT3 påverkas av hämmare, utan en mer detaljerad undersökning har också gjorts för att undersöka hur varje fosforyleringsställe influeras. I det fjärde projektet studerade vi hur ERK5 är involverat i Flt3-medierad signalering och transformation med hjälp av en specifik hämmare av Mek5, BIX02188. Eftersom MEK5 är uppströms om ERK5, leder hämning av MEK5 till hämning av ERK5. Det visar sig att cellens överlevnad och tillväxt hämmas när de behandlas med hämmaren, speciellt celler som uttrycker FLT3-ITD. Vi undersökte även vilka signaleringsvägar som är inblandade i dessa processer och visade att BIX02188 hämmar fosforylering av AKT och ERK1/2. Denna studie visar att ERK5 otvetydigt är involverat i FLT3-medierad signalering speciellt genom FLT3-ITD receptorn och därför kan denna hämmare troligtvis också bidra till potentiella cancerterapier. Sammantaget har vi visat att FLT3 receptorn signalerar olika beroende på vilken mutation som den bär. Vidare har vi studerat olika nya hämmare av olika signaleringsmolekyler och deras roll i FLT3 signalering. Allt detta visar att det finns fortfarande mycket att studera för att hitta rätt typ av terapi för de olika AML patienterna.

• author: Razumovskaya, Elena
• supervisor: Lars Rönnstrand; Jianmin Sun
• opponent: Professor Hallberg, Bengt, Umeå University
• organization: Department of Translational Medicine; Signal Processing Group-lup-obsolete (research group); BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
• publishing date: 2011
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry
• keywords: FLT3, AML, RTK, oncogene, ERK5, hematopoiesis
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2011:109
• pages: 138 pages
• defense location: Pathology bulding, UMAS, Malmö
• defense date: 2011-12-21 09:15:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86871-59-8
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Experimental Clinical Chemistry (013016010)
• id: b75c7eae-beb2-49e4-a14a-4d8f16b4d5fb (old id 2255711)
• date added to LUP: 2016-04-01 13:19:46
• date last changed: 2019-05-22 03:25:30