Preterm intraventricular haemorrhage - Effects of extracellular haemoglobin

Abstract

Intraventricular haemorrhage (IVH) is the most common brain lesion in preterm infants and is most commonly seen in the sickest children, with 15-20% of very preterm infants developing IVH. The mortality of infants with severe IVH is 20-50 % in the neonatal period and over 50 % of surviving infants develop post-haemorrhagic ventricular dilatation (PHVD) and 40-80 % develop severe neurological impairment, mainly cerebral palsy and mental retardation. To date there is no available therapy to prevent infants from developing either hydrocephalus or serious neurological disability. Infants who develop hydrocephalus receive a life-long ventriculo-peritoneal shunt, which is an efficient means of preventing ventricular distension but does not reduce neurological impairment.

Mechanisms leading to brain damage and hydrocephalus following IVH are complex and incompletely understood. However, inflammation and oxidative stress have been identified as two major culprits leading to irreversible damage in the vulnerable immature periventricular brain matter. Dysfunction of cerebrospinal fluid (CSF) production contributes to the development of PHVD but the exact molecular mechanisms remain unknown. The choroid plexus, which produces the CSF, is adjacent to the origin of IVH and is the first organ to encounter the extravasated blood. The subsequent haemolysis of red blood cells causes release of cell-free haemoglobin (Hb), which will with time further degrade releasing the toxic substances hemin, free iron, and various ROS (reactive oxygen species). Metabolites of cell-free Hb have been identified as an initiator of inflammation in the context of adult cerebral haemorrhage and inflammation of the ependyma has been shown to cause alterations of the blood-brain barrier (BBB).

Our working hypothesis is that cell-free Hb and its metabolites act as causal initiators of inflammation following IVH, constituting a critical up-stream event eventually leading to periventricular cell death. We further hypothesize that inflammation of the choroid plexus alters the ability of the epithelium to maintain CSF homeostasis contributing to the formation of post-haemorrhagic hydrocephalus.

To test the hypothesis we used the rabbit pup model of preterm IVH. It is excellently suited since rabbit pups have a germinal matrix with vulnerable capillary meshwork prone to rupture and have CNS maturation comparable to a 28-30 weeks preterm human infant. The application of high-frequency ultrasound enabled accurate measurements of haemorrhagic size and distension as well as ultrasound guided intraventricular injections and CSF sampling.

Following IVH there is a release of free haemoglobin in its reduced form, oxyHb, into the intraventricular space. OxyHb autooxidises to metHb over time and the concentration of the key inflammatory cytokine TNF-α is highly correlated to that of metHb. In an astrocyte cell culture, metHb induces TNF-α production whereas oxyHb does not. We therefore conclude that the formation of metHb is a key up-stream event leading to inflammation following IVH.

Following IVH there is extensive damage to the choroid plexus epithelium, which develops over time. There is a distinct inflammatory and cellular response induced by haemoglobin metabolites. Injection or co-incubation with haptoglobin, a haemoglobin scavenger, reduces or reverses the effects of haemoglobin both in vivo and in vitro.

Aquaporins (AQP) are water transporting transmembrane proteins playing a central role in CSF production. Following IVH the expression of AQP1, the key AQP in the choroid plexus, is down-regulated whereas the expression of AQP5, not previously described in the choroid plexus, is up-regulated. This probably represents an adaptive response to insult and might be of importance in understanding the development of PHVD.

In conclusion; following IVH released cell free haemoglobin, metabolized to metHb and hemin, constitutes a causal up-stream initiator of inflammation and cellular damage. Scavenging or removal of haemoglobin might be an efficient and feasible approach to reduce brain damage following preterm IVH.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Framsteg inom neonatal intensivvård har ökat överlevnaden hos extremt för tidigt födda barn. Prognosen för dessa barn är generellt god, men 15-20 % av drabbas av en större hjärnblödning där blod tränger in i hjärnans hålrum, vilket innebär en sämre prognos och en ökad dödlighet. Av barnen som överlever drabbas hälften av en ökad huvudomfångstillväxt på grund av en tilltagande vidgning av hjärnans hålrum som också trycker på omgivande hjärnvävnad och detta resulterar i en ökad risk för neurologiska handikapp vilket inkluderar både motoriska handikapp och inlärningssvårigheter. Barnen som utvecklar en bestående vidgning av hjärnans hålrum (vattenskalle) behöver oftast en livslång behandling med en så kallad shunt som dränerar överskott av vätska från hålrummen. Behandling med shunt är i sin tur förenad med komplikationer som till exempel stopp i shunten eller shuntinfektion. I dagsläget finns ingen etablerad behandling som förhindrar utveckling av vattenskalle eller senare neurologiska handikapp.

Mekanismer bakom de skador som uppstår i samband med hjärnblödning är komplexa och till en stor del okända. Dock har studier påvisat att inflammation och skadliga effekter av reaktiva fria syreföreningar skadar den omogna hjärnans vita substans. Även mekanismerna som ligger bakom uppkomst av vattenskalle efter en större hjärnblödning är också okända men störningar i produktionen av ryggmärgsvätska verkar vara en bidragande faktor. Området i hjärnan som producerar ryggmärgsvätska, plexus choroideus, ligger precis bredvid den plats där blödningen brukar uppstå och är således den struktur som först utsätts för kontakt med blod. I blödningen finns röda blodkroppar som sedan brister (hemolyserar) och frisätter fritt hemoglobin som är det protein som normalt fungerar som kroppens syretransportör. Fritt hemoglobin bryts i sin tur vidare ner till olika nervtoxiska substanser och studier hos vuxna har visat att fritt hemoglobin kan initiera en inflammation efter en hjärnblödning. Man har också kunnat påvisa att en uppkommen inflammation förstör den ömtåliga blod-hjärnbarriären.

Vår hypotes är att fritt hemoglobin och dess nedbrytningsprodukter initierar inflammation i den omogna hjärnan efter hjärnblödning och direkt orsakar hjärnskada. Vi tror också att inflammation av plexus choroideus orsakar störningar i produktion av ryggmärgsvätska som bidrar till utveckling av vattenskalle.

För att testa vår hypotes använde vi en prematur kaninmodell. Prematurfödda kaninungar har en mognadsgrad i det centrala nervsystemet som är jämförbar med ett prematurfött barn som är fött efter 28-30 graviditetsveckor. Kaninungar har också ett känsligt område i hjärnan varifrån det kan blöda precis som hos det för tidigt födda barn. För att på ett noggrant sätt kunna studera hjärnblödningarna använde vi en högupplösande ultraljudsmetod där vi kunde visualisera hjärnblödningarna och även kunde öka noggrannheten för provtagning av ryggmärgsvätska från hjärnans hålrum.

Efter hemolys frisläpps fritt hemoglobin ut i ryggmärgsvätskan. Vi har kunnat visa att det fria hemoglobinet och dess nedbrytningsprodukter initierar den inflammatoriska kaskaden efter en uppkommen hjärnblödning.

Vi kunde också visa att celler i plexus choroideus skadas allvarligt efter hjärnblödning och att denna skada utvecklas över tid samt att både inflammation i cellerna och själva cellskadan orsakas av fritt hemoglobin. Tillförsel av haptoglobin, ett kroppseget protein som binder hemoglobin, minskar denna skada avsevärt.

Aquaporiner är kroppsegna proteiner vars huvudfunktion är att transportera vatten över cellmembran och de tros spela en central roll i produktion av ryggmärgsvätska. Efter hjärnblödning såg vi en nedreglering av aquaporin 1 i plexus choroideus, den akvaporin som tros vara delaktig i produktion av ryggmärgsvätska. Vi konstaterade också en tydlig uppreglering av aquaporin 5, ett protein vars existens inte har beskrivits tidigare i strukturen plexus choroideus. Betydelsen av dessa förändringar är inte känd, men skulle kunna spela roll i utvecklingen av den ventrikelvidgning som ses efter blödning i ventrikelrummet.

Sammanfattningsvis, så visar denna avhandling att nedbrytning av fritt hemoglobin initierar inflammation och cellskada som sedan leder till hjärnskada efter hjärnblödning. Framtida studier får utvisa om behandling med haptoglobin skulle kunna vara en möjlig väg att blockera negativa effekter av fritt hemoglobin efter en uppkommen hjärnblödning, för att på så sätt minska risken för hjärnskador

• author: Sveinsdottir, Snjolaug
• supervisor: David Ley; Stefan Hansson; Ingrid Pupp; Bo Åkerström
• opponent: Professor Heep, Axel, School of Clinical Sciences Bristol University
• organization: Paediatrics (Lund)
• publishing date: 2014
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Pediatrics
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2014:62
• pages: 65 pages
• defense location: Belfragesalen, D15, BMC, Lund, Sweden
• defense date: 2014-05-24 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-87651-88-5
• language: English
• LU publication?: yes
• id: c13ddee5-f05c-4be1-86f9-892b70ea5c70 (old id 4754548)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:01:05
• date last changed: 2023-04-18 20:23:52