Not all those who wander are lost : A study of cancer cells by digital holographic imaging, fluorescence and a combination thereof

Abstract

Cells are commonly used in research to evaluate toxicity and efficiency of drugs. However, to further increase the usefulness of cells as well as the understandings of effects of different interventions, new methods must constantly be developed and refined. Today, many assays use end-point analysis of large populations of cells, to evaluate the research question. However, there are many cases when this kind of analysis hides important effects or behaviour of individual cells. Therefore, quantitative analysis of individual cells over long time periods is important for the complete understanding of the heterogeneity of cell populations. Dogital holographic imaging is a non-toxic quantitative method that can be used for analysis of individual cells over long periods of time. It is the major analysis method of this thesis.

In cancer, a small population of cells has gained the interest of cancer researchers since the cells resist treatment and have increased capability to migrate and form metastases. Those cells are called cancer stem cells, due to their many similarities to normal stem cells.

The interest in drugs that specifically target cancer stem cells has dramatically increased during the last decade. One of the drugs found to target cancer stem cells in multiple cancers is salinomycin, an ionophore which has been used as an antibiotic for more than 30 years. Almost immediately after addition to the medium of cells, salinomycin is found in the endoplasmatic reticulum resulting in increases the cytosolic Ca2+. This leads to further down-stream effects, which among others includes mesenchymal to epithelial transition.

We have used longitudinal tracking of cells in time-lapses acquired using digital holographic imaging to evaluate cell cycle times and movement of different cancer cell lines as well as normal cell lines. We found that small sub-populations of cells behaved differently than the rest of the individually tracked cells. The existence of these cells could not be distinguished in the population-based data we compared the result to. Further, we also analysed how treatment with salinomycin affected cell cycle time and cell movement.

To further develop our longitudinal assay, we combined digital holographic microscopy with fluorescence microscopy by acquiring images from two systems at the same field of view. We then combined the data from the longitudinal tracking with the expression of cell surface proteins specific for cancer stem cells. We found that salinomycin treatment decreased cell proliferation in cancer stem cells already within 24 hours of treatment, leading to a proportional decrease in this sub-population of the cells.

Abstract (Swedish)

Cancer är den näst vanligaste dödsorsaken i världen idag och
en tredjedel av Sveriges befolkning blir diagnosticerade med cancer under sin livstid.
Av alla cancerfall i Sverige, så är prostatacancer den vanligaste och
bröstcancer den näst vanligaste, medan hos enbart kvinnor så är bröstcancer den
vanligaste med 29,2 % av cancerfallen. Överlevnaden efter en cancerdiagnos har
i Sverige ökat sedan 70-talet från 48 till 74 % för kvinnor och 35 till 75 %
för män. Majoriteten av alla dödsfall i cancer beror inte på den primära
cancern, utan på metastaser som spridit sig till andra delar av kroppen.

Under senare år har forskare förstått att de celler som
startar tumörer och metastaser är en speciell typ av cancerceller, vilka har
karakteristiska drag som gör att de liknar normala stamceller. Därför kallas den
här typen av cancerceller för cancerstamceller. För normala stamceller är
överlevnad en av de viktigaste funktionerna, vilket också har visat sig stämma
för cancerstamcellerna. Vid behandling av tumörer, med många av de läkemedel
som används idag, så dör inte cancerstamcellerna eftersom de har speciella
strategier för att överleva även under förhållanden där övriga cancerceller dör.
Därför måste nya läkemedel utvecklas. Dessa nya läkemedel måste designas för
att vara mer effektiva mot cancerstamceller, samtidigt som de inte är för
giftiga mot vanliga friska celler.

Cancerstamcellerna vill gärna bryta sig loss från den
primära tumören och genom blodsystemet eller lymfkärlen transportera sig till
andra delar i kroppen för att bilda nya tumörer, metastaser. Därför är en
strategi i utvecklingen av nya cancerläkemedel att göra cellerna mindre benägna
att röra sig. Ett sådant läkemedel är salinomycin. Denna substans används idag
som antibiotika inom köttindustrin, men vid en genomgång av 16000 substanser urskilde
sig salinomycin genom att vara mer än 100 gånger så effektivt mot
cancerstamceller som ett av dagens cancerläkemedel, paclitaxel. Många
forskargrupper har undersökt effekten av salinomycin och det har visat sig att denna
substans bland annat förändrar cancercellerna från att vilja röra sig, till att
hellre vara still bland andra celler. Samtidigt har forskare också sett att vid
behandling med salinomycin, så minskar andelen cancerstamceller. Vi har i vår
forskning visat att denna minskning beror på att cancerstamcellerna slutar dela
sig mer än vad icke-stamcellerna gör efter behandling med salinomycin.

Inom cancerforskning, men även inom mycket annan forskning, så
kan forskningsmetoden baseras på celler, försöksdjur eller datormodeller. Ofta
finns dessa olika forskningsmetoder med för att komplettera till varandra. Vi
har i detta projekt använt enbart celler, vilka vi analyserat med hjälp av nya
mikroskopiska metoder. Vi vill med detta projekt inte bara utvärdera effekter
på cancerceller när vi behandlat dem med salinomycin, utan vi vill också
utvärdera vilka metoder som forskare kan använda. Nya metoder kan leda till
bättre resultat från den cellbaserade forskningen och tillsammans med
datormodeller kan de då på sikt ersätta djurförsök för en mer etisk forskning,
men också för att ge bättre resultat i forskningen.

Mikroskoperingsmetoden som vi baserat detta arbete på kallas
digital holografi. Bilden i digital holografi är en datorgenererad bild. Den
görs med hjälp av en laser, vilken delas i två identiska strålar. Ena strålen
går igenom provet med cellerna och den andra går bredvid provet. Sedan blandas strålarna
med varandra på en kamera, och datorn kan räkna ut en bild av cellerna i
provet. Denna bild är tredimensionell och i den går det att mäta hur cellerna
ser ut både i två och tre dimensioner. Lasern har låg intensitet och är ofarlig
för celler och därför går det att använda denna mikroskoperingsteknik för att
studera celler över lång tid utan att påverka dem. Vi har använt mikroskopet
till att ta bilder på samma celler var femte minut i 24 till 72 timmar.
Cellerna i bilderna har vi sedan följt genom hela tidsintervallet. Vi har då
kunnat kartlägga hur cellerna delar sig samt rör sig under denna tid. Metoden
ger oss möjligheten att se hur varje individuell cell beter sig, vilket är bra
eftersom vi vet att cancerstamceller kan vara en väldigt liten del av alla
celler. Med de vanliga metoderna som ofta används så analyseras alla celler
samtidigt och på samma sätt. Det finns då en risk att beteende och effekter på
få celler göms i all data och viktig information förloras.

Genom att följa varje individuell cell har vi kunnat hitta
små grupper av celler som har haft avvikande beteende. När vi behandlade med
salinomycin hittade vi ett fåtal celler som fortsatte dela sig efter 48 timmars
behandling. När vi jämförde med en metod där alla celler analyseras så kunde vi
konstatera att denna effekt var helt osynlig där. Vidare så har vi även
analyserat hur celler delar sig och rör sig på olika ytor. Dessa ytor är tänkta
att användas för att mäta hur mycket kraft celler använder när de drar sig
framåt, eftersom det visat sig att celler som bildar metastaser drar hårdare i
underlaget. Det vore därför bra med en enkel metod för att mäta detta. Det vi
upptäckte när vi följde cellerna på denna yta var att en del av cellerna var
kraftigt påverkade av själva ytan. De slutade dela sig och slutade röra sig. Detta
är viktigt att veta, för de forskare som vill använda denna typ av yta för att
mäta hur mycket kraft celler använder. De behöver då förstå att inte alla
celler trivs på ytan och därmed riskerar de att mäta på bara en viss typ av
celler.

Celler har proteiner och andra typer av molekyler på utsidan
av sitt cellmembran. De här molekylerna kan vara generella och finnas på många
olika typer av celler, eller också specifika och finnas speciellt på vissa
celler. Den här typen av protein används bland annat för att identifiera
cancerstamceller. Genom att använda antikroppar, som är designade att binda
till specifika proteiner, och som har en färgad molekyl på sig går det att
identifiera vilka celler som har proteinet på sitt membran och vilka som inte
har det. Det är sedan tidigare känt vilka proteiner som ska undersökas på de
celler som vi använder, för att identifiera om de är cancerstamceller eller
inte.

För att kunna se den färgade molekylen, fluoroforen, behövs
ett mikroskop med ljus speciellt designat för att se just den. I digital
holografi finns inte sådant ljus och det går därför inte att se denna typen av molekyler
med bara digital holografi. Vi kan därför inte identifiera de celler som beter
sig annorlunda i våra experiment. För att kunna det designade vi en
experimentell uppställning där vi kombinerade digital holografi med ett fluoresensmikroskop.
Efter bildtagningen i digital holografi, flyttade vi provet till det andra
mikroskopet och tog bilder på samma plats. Bilderna matchades sedan för hand
och det gick att se om cellerna vi följde var cancerstamceller eller inte. Det
var på det sättet vi kunde se att salinomycin påverkade celldelningen hos
cancerstamceller.

Genom detta projekt har vi kunnat visa nya cellbaserade
metoder för att utvärdera effekter på celler, både efter behandling med olika
substanser och efter att cellerna växt på olika material. De effekter vi hittat
har många gånger varit omöjliga att se vid användandet av mer vedertagna
metoder, eftersom effekterna enbart påverkat få celler. Detta visar hur viktigt
det är att ständigt utveckla metoderna vi använder vid forskning, för att
ständigt förbättra och utöka vår kunskap om sjukdomar och hur vi kan behandla
dem.

• author: Kamlund, Sofia
• supervisor: Stina Oredsson; Kersti Alm; Birgit Janicke
• opponent: Dr. Judson-Torres, Robert L., Department of Dermatology, University of California, San Francisco, USA
• organization: Functional zoology; BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
• publishing date: 2018-09
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Natural Sciences; Cell Biology
• keywords: Digital holography, longitudinal tracking, breast cancer stem cells, salinomycin, EMT, Digital Holography, longitudinal tracking of individual cells, breast cancer cells, Breast cancer, Salinomycin, cancer stem cells, Fluorescence microscopy, EMT
• pages: 172 pages
• defense location: Hörsal A213, Biologihuset, Sölvegatan 35, Lund
• defense date: 2018-10-12 13:00:00
• ISBN: 978-91-7753-840-0
• ISBN: 978-91-7753-841-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: c5531188-1210-46ea-a682-ca6104a77ccc
• date added to LUP: 2018-09-11 12:52:56
• date last changed: 2019-03-29 15:28:36