From genes to blooms : Diversity in microcystin phenotypes and mcy biosynthesis genes in the cyanobacterium Microcystis

Abstract

Cyanobacterial blooms are increasing in occurrence and frequency world-wide, mainly due to eutrophication and increased water temperatures. In freshwater, Microcystis is one of the most common bloom-forming genera, renowned for producing the toxin microcystin which is harmful to humans and other mammals. The ability of Microcystis strains to produce microcystins is largely due to the presence or absence of genes encoding microcystin biosynthesis (i.e. the mcy gene cluster), and the toxicity of Microcystis blooms is therefore dependent on the presence of toxin producing genotypes in the population. Numerous laboratory studies and field studies have aimed at explaining what environmental factors drive toxic blooms, however, with various results. Moreover, there is limited understanding of what the eco-physiological role of microcystin might be, and what factors influence microcystin concentration in the water. The aims of this thesis were to examine 1) the phenotypic and genotypic composition and variation in Microcystis, with regards to microcystin-production, 2) the association between mcy genotypes and the observed microcystin phenotypes, and 3) what environmental conditions favour microcystin-producing Microcystis during blooms, and are associated to microcystin concentrations in lake systems.
In paper I, Microcystis botrys strains were isolated and cultured from a single bloom, and their microcystin-profiles were analysed with mass spectrometry. I could show that the microcystin-producing M. botrys subpopulation contained multiple microcystin-phenotypes, and that the phenotypic diversity varied on a temporal scale. Not only were the proportions of microcystin-producing strains higher during early and late summer, but the microcystin-profiles were more diverse, and the number of microcystin variants produced by individual strains were higher. In paper II, I performed whole genome sequencing of the strains analysed in the first study. Thereby, I could characterise the variation within the mcy gene cluster, encoding for microcystin biosynthesis, and show how the composition of mcy genotypes relates to the observed phenotypes. One main finding was that both microcystin-producing and non-producing strains consist of several genotypes, that either possess the full mcy gene cluster, or partial operons. Based on the results of paper II, in paper III I developed a population-tailored marker for quantitative polymerase chain reaction (qPCR) targeting the mcyJ gene in the mcy gene cluster. I was thereby able to detect and quantify the abundance of toxigenic cells in natural populations of Microcystis spp., sampled from two Swedish lakes. I also sampled and analysed several environmental variables to determine which factors favour toxigenic vs non- toxigenic strains. The results confirmed the temporal succession of microcystin- producing and non-producing phenotypes observed in paper I. I could also show that toxigenic Microcystis spp. were associated with high concentrations of inorganic nitrogen, whereas microcystin concentrations were associated with soluble reactive phosphorus.
To conclude, my results show that there is inherent phenotypic and genotypic variation in Microcystis: the studied subpopulations contain multiple microcystin- phenotypes, as well as mcy genotypes. The presence of several mcy genotypes, found in both microcystin-producing and non-producing phenotypes, indicate that microcystin production might not be attributed to the presence or absence of mcy genes alone. Furthermore, toxic Microcystis blooms are likely driven by nutrient availability in the studied systems, which confirms that management strategies for bloom mitigation should focus on both phosphorus and nitrogen reduction.

Abstract (Swedish)

Cyanobakterier är urgamla prokaryoter, som finns i en mängd olika livsmiljöer över hela världen. Deras förmåga att utföra fotosyntes (det vill säga att använda solljus, vatten och koldioxid för att producera syre- och kolhydrater) gör dem till viktiga primära producenter, och tillsammans med andra växtplankton utgör de basen för akvatiska näringsvävar.
Vid optimala tillväxtförhållandena kan populationer av cyanobakterier snabbt öka i biomassa, och bilda täta blomningar. Dessa kallas ofta för algblomningar, även om cyanobakterier inte är egentliga alger, utan just bakterier. Algblomningar är inte ett nytt fenomen, men har under de senaste cirka 100-150 åren ökat både i förekomst och varaktighet. Detta beror till stor del på ökad näringstillförsel från t.ex. jordbruk och avlopp, men också av ökade vattentemperaturer och förändringar i nederbörd och klimat. Täta blomningar av cyanobakterier kan ha negativa effekter på akvatiska ekosystem, till exempel genom att ljustillgången minskar för andra organismer, på grund av minskad syretillgången i vatten då höga biomassor bryts ned, eller genom att konkurrera med andra växtplankton om näringsämnen. Många djurplankton kan inte, eller vill inte, äta cyanobakterier, och detta kan begränsa energiöverföringen från primärproduktion till högre trofiska nivåer. Framför allt kan många arter av cyanobakterier producera olika typer av sekundär-metaboliter, som ofta kan vara skadliga för andrar organismer. Blomningar av cyanobakterier kan därför leda till försämrad vattenkvalitet, vilket kan hota tillgången till dricksvatten. Blomningar av cyanobakterier är alltså problematiska, för ekosystem och också för samhällen världen över. Att förstå varför cyanobakterieblomningar generellt, och toxiska blomningar specifikt, ökar är därmed av stor vikt.
Arter inom släktet Microcystis är bland de vanligaste blommande cyanobakterierna i sötvatten. De är kända för att producera mikrocystiner, som är sekundärmetaboliter med skadliga effekter på vattenlevande organismer. Mikrocystiner har också toxiska effekter på däggdjur, exempelvis har kraftiga Microcystis-blomningar kopplats till dödsfall av husdjur och boskap, och lever- och tjocktarmscancer har kopplats till mikrocystin-förekomst i dricksvatten. Man vet dock inte varför Microcystis (och andra cyanobakterier) producerar mikrocystiner. Flertalet studier har genomförts, med syfte att kunna förklara vilken roll mikrocystin kan ha för cellen, dock med varierande resultat och slutsatser. Microcystis-stammar ("individer") är dessutom variabla när det gäller mikrocystin-produktion: alla stammar kan inte syntetisera mikrocystin, och de som kan producera dessa metaboliter samexisterar med stammar som inte kan göra det. Dessutom kan mikrocystin-producerande stammar syntetisera flera olika varianter av mikrocystiner. Trots omfattande forskning är det heller inte helt klarlagt vilka miljöfaktorer som påverkar dynamiken (det vill säga variationen i tid och rum) av mikrocystin-producerande och icke mikrocystin-producerande stammar av Microcystis under en blomning.
I mitt avhandlingsarbete har jag undersökt den fenotypiska och genotypiska variationen i lokala populationer av arten Microcystis botrys. Stammar av Microcystis är kapabla till att producera även andra sekundära metaboliter, men jag har i mitt arbete valt att fokusera på enbart mikrocystiner. Detta på grund av att de ofta är starkt toxiska, som jag beskrev i stycket ovan. Jag har också undersökt vilka miljöfaktorer som påverkar förekomsten av mikrocystin-producerande och icke mikrocystin-producerande stammar, samt mikrocystin-koncentrationer, i två skånska sjöar.
Med hjälp av kemiska analysmetoder kunde jag visa att den mikrocystin- producerande subpopulationen bestod av flera unika fenotyper ("mikrocystin- profiler"). Jag kunde också visa att mångfalden av dessa fenotyper varierade under provtagningsperioden. Till exempel var stammar som producerade många mikrocystiner vanligare under den tidiga provtagningen (i juni), medan den högsta andelen mikrocystin-producerande stammar förekom under den senare provtagningen (i augusti). Baserat på dessa resultat ville jag sedan undersöka om det finns variation även inom de gener som kodar för mikrocystinsyntes (mcy-generna). Jag sekvenserade därför hela genomen (det vill säga hela det genetiska materialet) av en del av de M. botrys-stammar jag analyserade i mitt första projekt. Jag kunde bland annat visa att stammar som inte producerade mikrocystin inte saknade alla gener i det genkluster som kodar för mikrocystin-syntes. Jag kunde också visa att det finns en stor variation i de gener som kodar för mikrocystin-syntes, både bland stammar som producerade mikrocystin och bland de som inte gjorde det. Det är första gången en sådan variation beskrivs i Microcystis-populationer från svenska sjöar.
I mitt tredje projekt undersökte jag vilka miljöfaktorer som är mest relaterade till förekomsten av mikrocystin-bildande Microcystis, samt till mikrocystin- koncentrationer, i två skånska sjöar. Under sommarmånaderna år 2018 och 2019 genomförde jag min fältprovtagning, och analyserade en mängd miljöparametrar (både biotiska och abiotiska) i sjöarna. Inom projektet utvecklade jag en metod för att kunna upptäcka och kvantifiera mikrocystin-producerande och icke microcystin- producerande Microcystis. Jag kunde visa att proportionerna av mikrocystin- producerande Microcystis var högre då halterna av inorganiskt kväve var höga, i början av sommaren (juni och tidiga juli), medan mikrocystin-koncentrationerna var högre i slutet av sommaren (augusti/september), vilket sammanföll med högre halter av inorganiskt fosfor.
Sammanfattningsvis visar mina resultat att det finns en hel del fenotypisk och genotypisk variation i Microcystis, och att mikrocystin-produktion inte enbart beror på om alla gener inom mcy-genkomplexet finns. Dessutom påverkas förekomsten av giftiga Microcystis-blomningar sannolikt av tillgången på näringsämnen i sjöar. För att minska riskerna att Microcystis-blomningar ska uppkomma, bör man inom vattenförvaltningen fokusera på att samtidigt reducera både fosfor och kväve.

• author: Johansson, Emma
• supervisor: Karin Rengefors; Torbjörn Säll; Dag Ahrén
• opponent: Doctor van de Waal, Dedmer, Netherlands Institute of Ecology (NIOO-KNAW)
• organization: Division aquatic ecology; Aquatic Ecology (research group)
• alternative title: Från gener till blomningar : Variation i mikrocystin-fenotyper och mcy biosyntes-gener i cyanobakterien Microcystis
• publishing date: 2023-05-11
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Ecology
• keywords: limnologi, algblomning, cyanobakterier, cyanotoxiner, limnology, cyanobacterial blooms, cyanotoxins
• edition: 1
• pages: 194 pages
• defense location: Blå hallen, Ekologihuset.
• defense date: 2023-06-15 09:00:00
• ISBN: 978-91-8039-664-6
• ISBN: 978-91-8039-663-9
• language: English
• LU publication?: yes
• id: fbde5d14-6e5f-4e9e-88cf-fb77b244acdf
• date added to LUP: 2023-05-16 22:21:25
• date last changed: 2023-10-24 03:07:28