Advanced

Peptide fragment screening towards a new inhibitor of neutrophil elastase

Szakacs, Tomas LU (2019) KLGM15 20182
Food Technology and Nutrition (M.Sc.)
Abstract
The main purpose of this master thesis was to test a novel approach of finding leads for new pharmaceuticals, by using Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) in combination with Weak Affinity Chromatography (WAC). Put in a more concrete way, the objective was to find a lead for a better human neutrophil elastase inhibitor. The plan was to take advantage of the fact that the tripeptide Valine-Proline-Valine is a known binder to elastase, and synthesis peptide libraries of tripeptides and test the binding affinity using WAC. Unfortunately, the in-house method of binding the protein onto the WAC-column was not compatible with human elastase, so porcine elastase was used instead. A hit for a new lead was possibly discovered, but the data are... (More)
The main purpose of this master thesis was to test a novel approach of finding leads for new pharmaceuticals, by using Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) in combination with Weak Affinity Chromatography (WAC). Put in a more concrete way, the objective was to find a lead for a better human neutrophil elastase inhibitor. The plan was to take advantage of the fact that the tripeptide Valine-Proline-Valine is a known binder to elastase, and synthesis peptide libraries of tripeptides and test the binding affinity using WAC. Unfortunately, the in-house method of binding the protein onto the WAC-column was not compatible with human elastase, so porcine elastase was used instead. A hit for a new lead was possibly discovered, but the data are inconclusive as the reference binder did not show any binding in the assay, raising the suspicious of denatured protein. To validate the method, the same setup, but with a different protein, porcine trypsin and reference binder Threonine-Arginine-Glutamine was also evaluated. According to the results tripeptides with Ac-X-Glutamine-Valine-NH2 showed potential to have inhibitory effect, but the design of the additional libraries focusing on this sequence showed negative results. Any future experiments should test amino acids with saturated carbon side chains in position X, as all amino acids in this position for the first trypsin WAC run were of that type. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Undersökning av en ny metod att söka efter inhibitorer
Vad görs när immunsystemet, systemet byggt för att skydda oss, attackerar oss istället? I dagsläget finns inte så mycket man kan göra. Jag har därför undersökt en ny metod för att hitta ämnen som ska kunna hindra det trasiga immunsystemet från att skada!
Framsteg inom medicinen är bland de viktigaste som kan göras för mänsklighetens fortlevnad. Ett specifikt område inom medicin där det är relativt snålt med detta är immunsystemet. Men immunsystemet är väl bra som det är ju? Mja, visst, när allt funkar som det ska. Ibland slår immunsystemet slint och börjar attackera kroppen, då behövs det läkemedel som tillfälligt kan hindra, med ett finare ord, inhibera, därav ordet inhibitor, de... (More)
Undersökning av en ny metod att söka efter inhibitorer
Vad görs när immunsystemet, systemet byggt för att skydda oss, attackerar oss istället? I dagsläget finns inte så mycket man kan göra. Jag har därför undersökt en ny metod för att hitta ämnen som ska kunna hindra det trasiga immunsystemet från att skada!
Framsteg inom medicinen är bland de viktigaste som kan göras för mänsklighetens fortlevnad. Ett specifikt område inom medicin där det är relativt snålt med detta är immunsystemet. Men immunsystemet är väl bra som det är ju? Mja, visst, när allt funkar som det ska. Ibland slår immunsystemet slint och börjar attackera kroppen, då behövs det läkemedel som tillfälligt kan hindra, med ett finare ord, inhibera, därav ordet inhibitor, de delar som gör skada.
En viktig del av immunsystemet är de vita blodcellerna, de är kroppens försvarare mot olika främmande saker, exempelvis bakterier eller virus som vill bryta sig in i kroppen. Enzymet som valdes att testa vår metod på, det vill säga försöka hitta en inhibitor till, heter neutrofilelastas.
Enzymer är katalysatorer, dvs. påskyndare. Enzymer består av en kedja av aminosyror, där en aminosyra kan ses som byggstenen för enzymer. Tänk på aminosyrorna som pärlor på ett ihopknycklat pärlhalsband, och enzymet som det ihopknycklade halsbandet. Någonstans på detta halsband, finns ett aktivt centrum, där reaktioner skyndas på. En inhibitors syfte är att blockera aktiva centrumet så att enzymet inte kan öka hastigheten på reaktioner, vilket även kan betyda att reaktionen inte kommer ske alls.
Den vita blodcellen som heter neutrofil sprutar ut enzymet neutrofilelastaset när den hittar något i kroppen den inte gillar. Neutrofilelastaset tuggar då endast sönder den främmande saken, i alla fall vanligtvis. Två saker kan ske som gör neutrofilelastaset farligt för kroppen:
1. Kroppens ”stoppmekanism”, det som signalerar att jobbet är färdigt och det är dags att återgå till det normala, är ur funktion.
2. Den lokala koncentrationen av bakterie/virus etc. är låg.
När något av ovanstående händer kan neutrofilelastaset börja attackera kroppen istället, särskilt lungorna. Neutrofilelastas kan orsaka kroniskt obstruktiv lungsjukdom (KOL).
Under fem månaders tid testade jag därför en ny metod för att försöka få fram en inhibitor. Tyvärr hittades ingen inhibitor, varken till neutrofilelastaset eller trypsin som denna metod också undersöktes på. Däremot tror jag ändå på metoden trots att det inte lyckades med just dessa två protein.
Metoden gick ut på att massproducera aminosyrekedjor, dvs pärlhalsbandsbitar, med tre aminosyror per kedja. Mellan 15 till 24 unika aminosyrakedjor var lösta i 13 olika lösningar, vilket gav ca 200 kedjor totalt, och dessa testades med Weak Affinity Chromatography (WAC).
I WAC, något förenklat, har man två packade rör. Det ena röret är bara en kontroll och i det andra binder man fast sitt enzym. Man pumpar sen alla sina lösningar genom de båda rören. Man jämför sedan, med en referens som man vet sätter sig i enzymets aktiva centrum, hur länge kedjorna befunnit sig i rören. Om någon av kedjorna befinner sig längre tid i enzymröret än referensen har man potentiellt hittat startskottet till en ny inhibitor! (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Szakacs, Tomas LU
supervisor
organization
course
KLGM15 20182
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
pharmaceutical technology, läkemedelsteknologi
language
English
id
8972685
date added to LUP
2019-04-11 14:31:34
date last changed
2019-04-11 14:31:34
@misc{8972685,
  abstract     = {The main purpose of this master thesis was to test a novel approach of finding leads for new pharmaceuticals, by using Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) in combination with Weak Affinity Chromatography (WAC). Put in a more concrete way, the objective was to find a lead for a better human neutrophil elastase inhibitor. The plan was to take advantage of the fact that the tripeptide Valine-Proline-Valine is a known binder to elastase, and synthesis peptide libraries of tripeptides and test the binding affinity using WAC. Unfortunately, the in-house method of binding the protein onto the WAC-column was not compatible with human elastase, so porcine elastase was used instead. A hit for a new lead was possibly discovered, but the data are inconclusive as the reference binder did not show any binding in the assay, raising the suspicious of denatured protein. To validate the method, the same setup, but with a different protein, porcine trypsin and reference binder Threonine-Arginine-Glutamine was also evaluated. According to the results tripeptides with Ac-X-Glutamine-Valine-NH2 showed potential to have inhibitory effect, but the design of the additional libraries focusing on this sequence showed negative results. Any future experiments should test amino acids with saturated carbon side chains in position X, as all amino acids in this position for the first trypsin WAC run were of that type.},
  author       = {Szakacs, Tomas},
  keyword      = {pharmaceutical technology,läkemedelsteknologi},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Peptide fragment screening towards a new inhibitor of neutrophil elastase},
  year         = {2019},
}