BMP implants in bone formation. Studies in rabbits and rats

Abstract

Bone morphogenic proteins, BMPs, are a group endogenous proteins that are highly conserved through evolution. The amino acid sequences of about 15 different BMPs are now known and recombinant human BMPs are commercially available. Implantation of an individual BMP protein is sufficient to induce bone formation even at a subcutaneous site. Our initial studies discovered inhibition of bone formation by BMP-2 implanted in a titanium chamber model in rabbit tibia. This paradoxical effect was previously unknown, and lead to studies trying to elucidate the required conditions for BMPs to induce bone formation. Inhibition of bone formation was still found, despite testing different doses of BMP-2, another BMP (OP-1), a different carrier, and altered microenvironment. Stimulation of bone formation by BMP-2 was finally shown in a similar titanium chamber model by adding micromotion. The used titanium model induces minimal fracture surfaces when implanting the BMP and thus a minimal trauma unless micromotion was added. Therefore, we conclude that a certain amount of trauma probably is a prerequisite for BMP induction of bone formation. Impaction of morselized allografts in rat titanium chamber models slowed down new bone ingrowth. This delay was overcome by adding OP-1 to the impacted graft. A marrow-like cavity forms by resorption behind the bone ingrowth frontier in impacted bone allografts. In situations where the graft must resist deformation during remodeling, this resorption might compromise the final result. Bisphosphonates bind to the mineral phase of bone and induce cell death to osteoclasts resorbing the bone. By treating impacted allografts in rats with a bisphosphonate we increased the bone density (both new bone and remaining graft) after 6 weeks. When treating allograft with both a bishosphonate and a BMP (OP-1) the previous increase in new bone ingrowth by OP-1 was lost, suggesting that, at least in some grafting situations, resorption may be a prerequisite for stimulation of bone ingrowth by a BMP.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I ben finns tre olika sorters celler, osteoblaster, osteocyter och osteoklaster. Osteoblaster och osteocyter härstammar från stamceller som kallas stödjevävnadens stamceller och svarar för uppbyggnad och upprätthållande av benvävnaden medan osteoklasterna härstammar från de blodbildande stamcellerna och står för nedbrytning av ben. Ben är den enda vävnaden i kroppen som har förmågan att läka helt utan mikroskopiskt synliga ärr, men frakturläkning är en långsam process som leder till långa immobiliseringstider med obehag för patienten och sjukskrivning. Benläkningsprocessen styrs och regleras via ett förutbestämt schema som utlöses i frakturögonblicket. Detta är delvis känt och innefattar bla frisättning av s.k. benmorfogena proteiner.



BMP, TGF-ß och biphosphonater



1965 visade Urist att ben, där mineralen tagits bort (demineraliserat benmatrix, DBM), bildade ben när det inopererades i muskel på kanin och råtta. Detta ledde till jakten på ämnet som skulle frälsa världen från ortopediska problemsituationer såsom utebliven frakturläkning, bindvävsläkning istället för benläkning och dålig omvandling av icke kroppseget transplanterat bengraft till kroppseget ben.



Ett ton koben gick åt för att fastställa aminosyrasekvensen av dessa första proteiner som döptes till "benmorfogena proteiner", BMP, och sedermera visade sig tillhöra en större grupp proteiner som kallas "transforming growth factor beta", TGF-ß. TGF-ß familjen är en stor grupp proteiner med många olika effekter, bl.a. modulerar de immunsystemet. TGFß-1,2 och 3 har visat sig kunna stimulera benbildning i vissa studier, men hämmar den i andra och det verkar som om effekten beror på vilken experimentmodel som används. Olika BMPs aminosyrasekvens är mycket lika mellan olika djurarter och den största överensstämmelsen med däggdjurens återfinns i bananflugan. Idag har man identifierat ca 15 BMP som visat sig ha många olika effekter. Frånsett benbildning är olika BMP även delaktiga i fosterutveckling vid anläggandet av armar, ben, hjärta, njurar, testiklar, hjärna och tänderna.



Bifosfonater är läkemedel som används inom osteoporosbehandlingen. De binder starkt till mineraldelen av ben och inducerar celldöd i de osteoklaster som bryter ner benet. Vid situationer när bengraft inopereras vill man att graftet ska omvandlas till kroppseget levande ben, vilket innebär att både nedbrytningen av graft och uppbyggnaden av nytt ben skall ske parallellt. Ibland är man beroende av graftet för hållfasthetens skull och om då nedbrytningen föregår uppbyggnaden kan den mekaniska hållfastheten riskeras.



Det är visat att både stödjevävnadens och de blodbildande stamcellerna kan stimuleras av BMP så att de bildar osteoblaster respektive osteoklaster. Båda är delaktiga i frakturläkningsprocessen och denna avhandling har i huvudsak undersökt två olika BMPs förmåga att påverka benbildningen utifrån olika förutsättningar.



Metoder och delarbeten



Vi har använt titankammare inopererade i skenbenen på råtta och kanin. Kamrarna har kontakt med de benbildande cellerna i skenbenet och ben växer in i kammaren. Efter en viss tid skördas den inväxta benvävnaden. Man kan därefter histologiskt studera och mäta mängden ben som vuxit in i kammaren. Kaninkammaren växer fast i benet på 6 veckor. Den kan öppnas via en liten hudincision och man kan på så sätt skörda och inplantera, t.ex. proteiner man önskar studera. Det kan göras upprepade gånger. Kaninkammaren finns också som en variant vilken kan ruckas från utsidan och man kan då efterlikna en instabil fraktursituation. Råttkammaren opereras däremot in samtidigt med det material man önskar studera och råttan avlivas när preparaten uttages. Vi har studerat effekten av proteiner (BMP-2, BMP-7, TGFß-1) samt en bifosfonat vad avser beninväxt in i olika material såsom hydroxylapatit, kollagen typ-1 och bengraft.



I delarbete I använde vi råttkammaren som fylldes med hydroxylapatit behandlat med antingen TGFß-1 eller BMP-2 i olika doser och fann att TGFß-1 hämmade benbildningen med stigande doser medan BMP-2 ökade benbildningen. I delarbete II lades BMP-2 på en kollagenbit, in i den rigida kaninkammaren varvid vi fann hämning av benbildningen. Delarbete III består av 6 delstudier där vi försökte att klargöra varför den annars förväntade benbildningsstimuleringen av BMP, hämmade benbildningen i den rigida kaninkammaren i delarbete II. Vi konstaterade att hämningen kvarstod trots a) lägre doser, b) utbyte av BMP-2 mot BMP-7 och c) byte av kollagenbäraren mot hydroxylapatitbärare. d) Vi modifierade kammaren för att celler utanför också skulle få tillträde utan att finna stimulering och e)vi lyckades inte identifiera cystbildning. f)BMP-2 på kollagen stimulerade dock beninväxten kraftigt i råttkammaren. I delarbete IV upprepade vi försöket med BMP-2 på kollagen, men denna gång i den ruckbara kaninkammaren, och utsatte kammaren för dagliga vridningar i 3 veckor. Benbildningen stimulerades då ånyo . I delarbete V studerade vi bengraft i kammaren, och fann att hårt packade graft fördröjer ny beninväxt. Vi kunde inte påvisa att det berodde på immunologiskt ofördelaktiga faktorer. Däremot kunde denna fördröjning helt elimineras och faktiskt vändas till stimulering av beninväxtdistansen mha tillsatt BMP-7. I delarbete VI studerade vi bengraft med 2 olika bendensitetsnivåer som behandlats med bifosfonat eller BMP-7 samt kombinationer av de båda. Bendensiteten i graftet vid experimentets slut ökade kraftigt efter behandling med bifosfonat. Kombinationsbehandling med BMP-7 plus bifosfonat åstadkom en hög bendensitet men den positiva effekten på beninväxtdistansen av BMP-7 kvarstod endast om ursprungsgraftet var hårt packat.



Sammanfattning



Den hämmande effekten av tillsatt BMP i den rigida kaninkammaren är oväntad och därför intressant. Att vi kunnat vända hämningen till stimulering i en instabil kaninkammare, där dagliga vridningar kan likställas med tillfogad skada, antyder att benbildningsförmågan har att göra med traumat eller något som traumat utlöser, ev. en inflammatorisk reaktion. Situationer med stort vävnadstrauma är de vanligaste modelluppställningarna när det gäller att påvisa positiv effekt på benbildningen av BMP i djurmodeller (Tabell 1). Modeller med minimalt vävnadstrauma, som vår rigida kaninkammare, där det enda trauma som tillförs består i att ta ut en benbit och på så sätt åstadkomma en frakturyta på 2x1 mm2 är ovanliga. I situationer med moderat vävnadstrauma har BMP-7 inte överträffat gängse behandling (Jeppsson et al. 1999; Laursen et al. 1999; Friedlaender et al. 2001; Johnsson et al. 2002). Vid stora trauma, har BMP-7 visat lovande resultat enligt preliminära data från en stor multicenterstudie där man behandlar öppna underbensfrakturer med BMP-2 (Govender et al. 2002). Om graden av trauma likställs med den inflammatoriska process som sätts igång, föreligger nu data för att prostaglandin E2 är essentiell för normal rekrytering och utmognad av osteoblaster från bindvävens stamcellspopulation (Zhang et al. 2002) vilket därmed skulle kunna förklara de varierande svaren på tillfört BMP. BMP stimulerar även osteoklaster (Kanatani et al. 1995; Kaneko et al. 2000) och man skulle kunna tänka sig att BMP-effekten på osteoklasterna kvarstår trots utebliven stimuli på osteoblasterna vid minimalt vävnadstrauma.



Omvandlandet av icke kroppseget graft till eget ben förlångsammas av att man packar graftet hårt. Vi har inte kunnat visa att det spelar någon roll om graftet är immunokompatibelt eller ej, men vid tillsättande av BMP-7 fann vi att beninväxtdistansen överträffade t.o.m. den som hittas i icke packade graft. Dock fann vi att benkvaliteten bakom beninväxtfronten var märgliknande, med låg bendensitet och det är möjligt att detta även kan bero på BMPs förmåga att stimulera osteoklaster. För att kompensera för BMP-stimuleringen av osteoklaster vid tillfällen då mekanisk integritet är nödvändig under hela remodelleringen provade vi kombinationsbehandling med BMP och bifosfonat på graft med varierande bendensitet. Detta gav mycket hög densitet av benet efter 6 veckor men bifosfonateffekten slår ut positiva effekter av BMP-7 förutom i mycket kraftigt packade graft.

• author: Jeppsson, Charlotte
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Svensson, Olle, Professor, Orthopedic Department, Norrland University Hospital, Umeå
• organization: Hand Surgery, Malmö (research group)
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Orthopedics
• keywords: ortopedi, traumatologi, graft resorption., Kirurgi, Surgery, orthopaedics, traumatology, bone formation, bone graft, hydroxyapatite, collagen, bisphosphonate, rat, rabbit, titanium chamber, BMP, TGF-ß
• pages: 71 pages
• defense location: Lund University Hospital, Föreläsningssal 1.
• defense date: 2003-05-16 09:15:00
• ISBN: 91-628-5614-6
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: :1: Aspenberg P, Jeppsson C, Wang J-S, Boström M.Transforming growth factor beta and bone morphogenetic protein 2 for bone ingrowth; a comparison using bone chambers in rats.Bone 1996; 19(5): 499-503. Article: 2: Jeppsson C, Aspenberg P.BMP-2 can inhibit bone healing. Bone-chamber study in rabbits.Acta Orthop Scand 1996; 67(6): 589-92. Article: 3: Jeppsson C, Boström M, Aspenberg P.Intraosseous BMP implants in rabbits. Inhibitory effect on bone formation.Acta Orthop Scand 1999; 70(1): 77-83. Article: 4: Boström MP, Aspenberg P, Jeppsson C, Salvati EA.Enhancement of bone formation in the setting of repeated tissue deformation.Clin Orthop 1998; May(350): 221-8. Article: 5: Tägil M, Jeppsson C, Aspenberg P.Bone graft incorporation. Effects of osteogenic protein-1 and impaction.Clin Orthop 2000; Feb(371): 240-5. Article: 6: Jeppsson C, Åstrand J, Tägil M, Aspenberg P.A combination of bisphosphonate and BMP additives in impacted bone allografts.Accepted for publication in Acta Orthop Scand 2003.
• id: 9949e59a-3680-49ee-930e-67a7eb936858 (old id 465660)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:04:16
• date last changed: 2018-11-21 20:56:33