Aggregation propensity of homologous peptides as studied by 1H NMR-spectroscopy

Abstract

The aggregation propensity of four GnRH analogues, namely D-Phe6-GnRH, ozarelix, cetrorelix and degarelix has been studied with 1H NMR spectroscopy in 100 % H2O, while tracking changes in pH. A method was developed to study aggregation propensities by variations in absolute integral values over time and with concentration. The method provided an intuitive visual comparison of the aggregation propensities of the peptides and also a rough estimation of the fraction of peptides that were not involved in aggregates. This could be applied in early stages of development of peptide therapeutics when ranking or choosing an appropriate candidate.

Ozarelix, cetrorelix and degarelix have a single positive charge at the studied concentrations and they all show signs of aggregation. The counterion, acetate, is involved in the aggregates of ozarelix and cetrorelix but not for degarelix. The pH values for cetrorelix and ozarelix increased with concentration, this suggests that aggregates that incorporate acetate also incorporate a proton from the solution. D-Phe6-GnRH is the only peptide studied that has a Histidine residue. The pH values of the D-Phe6-GnRH solutions at the concentrations studied coincide with the pKa of Histidine. Thus, D-Phe6-GnRH has a higher cationic charge than the other peptides of this study and that could explain why D-Phe6-GnRH does not aggregate.

Popular Abstract (Swedish)

Studie av aggregeringstendenser hos en homolog serie peptider med NMR-spektroskopi

Examensarbetet utvärderar tillämpningen av 1H NMR-spektroskopi med vattenundertryckning vid en första undersökning av aggregeringsbeteende hos fyra närbesläktade läkemedelsmolekyler.

Utveckling av peptidläkemedel står inför många svårigheter. För det första är de är relativt nya på marknaden. Läkemedelsutvecklare har därför en begränsad mängd publicerat material att använda som guide. Peptider har en komplicerad dynamik som påverkas av sin miljö. De har dessutom kort halveringstid i kroppen.

Vad som händer med ett peptidläkemedel i kroppen kommer bero på dess formulering, om det ges som spruta eller tablett t.ex. Peptider är mycket känsliga för salter och lösningsmedel. Det finns därför en risk att formuleringen kan inducera aggregering. Aggregering är när molekyler bildar strukturer utan att kemiskt binda till varandra, ett fenomen som kan leda till både nytta och skada. Det finns många typer av aggregat vilket gör att detta kan få flera olika konsekvenser. I utvecklingen av ett nytt läkemedel är det viktigt att förstå hur den aktiva substansen och eventuella sidoprodukter som aggregat, beter sig i olika miljöer. Detta för att undvika farliga konsekvenser i kroppen.

En formulering anpassas efter peptidens egenskaper, men det är också viktigt att formuleringen är användbar för patienter. Den vanligaste formuleringen för peptidläkemedel är i form av en spruta. Degarelix är ett exempel på en peptid med en smart lösning som innebär en mer bekväm dosering för patienter. Degarelix används som aktiv substans mot prostatacancer. Degarelix blir injicerat i underhudsfettet och aggregerar för att bilda en depå. Läkemedlet löser sig från depån allt eftersom, något som innebär att färre injiceringar för patienten. En dos degarelix förnyas efter 28 dagar medan en närbesläktad peptid bryts efter bara några timmar i kroppen.

Ett exempel på skadlig aggregering sker när ett specifikt protein i kroppen viker om sig till en struktur som underlättar aggregering. Aggregaten i detta fall blir långa trådar som bildar plack i hjärnan och leder till Alzheimers sjukdom. Mycket forskning kretsar kring denna typ av aggregat.

I utvecklingen av framtida läkemedel skulle det underlätta med en simpel metod som kan påvisa aggregering för att utesluta skadligt beteende men också påvisa användbara aggregat. Till denna studie valdes fyra peptider (inklusive degarelix) av liknande strukturer som tidigare påvisat olika aggregeringsbeteenden. Detta för att se om en undersökning med NMR-spektroskopi kunde validera och eventuellt ge en ny inblick i deras olika beteenden.

Majoriteten av analyserna utfördes i rent vatten, detta är ovanligt för analyser med NMR. Vanligtvis används ett deutererat lösningsmedel, som tungt vatten, eftersom det ger direkt jämförbara resultat. Tidigare försök har dock påvisat att tungt vatten påverkar aggregeringstendenser hos peptider. Därför utvecklades en metod där data från körningar i rent vatten kunde jämföras.

Resultaten var i linje med tidigare resultat och andelen peptider som var involverade i aggregat kunde uppskattas inom grova marginaler. Dessutom påvisades nya intressanta aspekter som beteende över tid och huruvida aggregaten involverade peptidens motjon (alla peptider var ett salt). Sammanfattningsvis pekar detta på att den nya metoden visar god potential för att jämföra aggregerings tendenser inom en serie peptider och att den kan användas för att välja peptidkandidater i ett tidigt skede av utvecklingsprocessen.

• author: Hjalte, Johanna
• supervisor: Dan Lundberg; Ola Wendt; Andreas Hugerth
• organization: Food Technology and Nutrition (M.Sc.)
• course: KLGM15 20191
• year: 2019
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Chemistry; Technology and Engineering
• keywords: aggregation, peptides, proton NMR, pharmaceutical technology, läkemedelsteknologi
• language: English
• id: 8987912
• date added to LUP: 2019-07-04 16:54:49
• date last changed: 2019-07-04 16:54:49