Trypsinogen and Its Activation in Acute Pancreatitis

Abstract

Pancreatic enzymes, neutrophils, free radicals and cytokines are involved in the pathophysiology of AP. Clarification of their interaction and time-course will improve our understanding of AP and provide a better basis for treatment. 20% will develop severe AP and benefit from improved treatment why an accurate test for prediction of severity is needed. Aims: To investigate the interactions between those factors and the accuracy of markers of proenzyme leakage (anionic and cationic trypsinogen=ATg and CTg) and free trypsin activity (carboxypeptidase B activation peptide =CAPAP) as predictors of severity. Free radical action may lead to intracellular enzyme activation. Diminished activation of Tg was found one-three days after pancreas transplantation in pigs, when allopurinol treatment was given. Thus, early intracellular events are of importance for later extracellular activation of Tg which, may be due to autoactivation or be secondary to inflammation. We found no proof of inflammation or neutrophil activation preceding the activation of Tg in ERCP- induced AP, indicating primary Tg-activation in AP. ATg but not CTg levels in urine correlated to severity in human AP but the specificity was too low for clinical use as a severity predictor. We developed a TAP-assay (Tg activation peptide) and could show an instable immunoreactivity in serum, and that the immunoreactivity in urine consists of a degradation product of TAP. CAPAP is not degraded after sampling. CAPAP is superior to ATg as a severity predictor, according to our study where pre-set cut-off levels were used. In conclusion: 1) Tg activation is a central event in the pathophysiology of AP, 2) free radicals is of importance for this, probably extracellular activation, 3) inflammation could not be shown to precede Tg activation, 4) TAP is degraded in the circulation and is recovered as a pentapeptide in urine in AP, and 5) CAPAP is an accurate predictor of severity in human AP.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

BAKGRUND Bukspottkörteln, pankreas, är ett organ med två huvudfunktioner. Dels bildar körteln ett flertal hormoner som framförallt styr sockeromsättningen och dels bildar pankreas ett bikarbonatrikt sekret som neutraliserar den sura magsaften i tolvfingertarmen och som innehåller förstadier (proenzym) till ett flertal enzym verksamma vid nedbrytning av födans beståndsdelar. Denna avhandling sammanfattar fem delarbeten som handlar om inflammation i pankreas vilket huvudsakligen får konsekvenser i den sekret- och enzymbildande delen- exokrina pankreas. Akut inflammation i pankreas eller akut pankreatit (AP) drabbar 38/100 000 personer och år i Malmö. I de flesta fall läker sjukdomen utan vare sig specifika behandlingsåtgärder eller kvarstående problem. I ca 10-20% av fallen blir förloppet emellertid komplicerat med långa vårdtider på intensivvårdsavdelning, eventuellt behov av upprepade operationer samt en dödlighet i dessa fall på 10-20%. De två dominerande orsakerna till AP är passage av gallstenar från gallblåsan, via gallgången förbi bukspottkörtelgången, samt överkonsumtion av alkohol. Tillsammans svarar dessa orsaker för 70-75% av fallen. Diverse andra orsaker är beskrivna men i ca 20% kan någon orsak inte påvisas. Sättet på vilket de olika orsakerna leder till AP är inte fullt klarlagt. Det tidiga skeendet torde vara olika vid olika orsakers inverkan. Vid gallstensorsakad AP är backflöde av galla upp i bukspottkörtelgången till följd av gallsten i nedre delen av gallgången, samt hinder för bukspottkörtelns sekretutsöndring till tolvfingertarmen olika hypoteser om hur inflammationen uppkommer. Uppkomstmekanismen vid alkoholorsakad AP torde istället vara en direkt skadlig påverkan på bukspottkörtelns sekretbildande celler i kombination med en stimulering av körteln. Oberoende av orsak kan olika svårighetsgrader ses. Detta talar för att efter det inledande skedet, som varierar med orsaken, så sker utvecklingen av inflammationen i körteln på likartat sätt oberoende av orsak. Denna utveckling av inflammationen innefattar en oförmåga hos körtelcellerna att utsöndra sina proenzym. I dessa fall sker aktiveringen av proenzymer till aktiva vävnadsnedbrytande enzymer inne i pankreas istället för som normalt i tolvfingertarmen. Trypsinogen (Tg) är det dominerande proenzymet och aktiveras till trypsin som i sin tur kan aktivera övriga proenzym. Pankreas egna enzym skadar på detta sätt körteln och en inflammation utvecklas. Flertalet andra inflammationsbefrämjande faktorer deltager i processen, t ex vita blodkroppar, fria syreradikaler som är vävnadsskadande substanser vilka bildas efter relativ syrebrist i vävnader, cytokiner som förmedlar information mellan celler samt olika sk kaskadsystem som aktiveras i samband med inflammatoriska reaktioner. Det är inte i detalj känt på vilket sätt dessa olika inflammationsbefrämjande faktorer samspelar. Ökad kunskap om dessa faktorer samt deras samspel vid AP kan förhoppningsvis skapa förutsättningar för bättre behandling av de patienter som får en svår AP. Milda fall av AP behöver inte resurskrävande insatser men det är idag svårt att tidigt och säkert förutsäga vilka patienter som blir svårt respektive lindrigt sjuka. Att utarbeta en bra metod för att förutsäga svårighetsgraden är därför av vikt.



SYFTE, METODER OCH RESULTAT Syftet med delarbete I har varit att studera på vilket sätt fria syreradikaler påverkar läckage av Tg från pankreasceller respektive aktiveringen av Tg till trypsin i en experimentell pankreastransplantationsmodell på gris. Tjugofyra grisar genomgick pankreastransplantation. Behandling med två olika typer av hämmare av fria syreradikaler gavs till 14 av grisarna medan 10 grisar var kontroller. Vi fann minskat läckage av Tg samt minskad aktivering till trypsin dagarna efter tranplantationen för grisar behandlade med den ena typen av använd hämmare (allopurinol, en liten molekyl som lättare transporteras in i cellerna än större hämmare). Vår tolkning blir att fria syreradikalers verkan inne i pankreascellerna vid transplantation har betydelse för senare läckage av Tg samt för dess senare aktivering till trypsin. I delarbete II har vi undersökt om läckage av två typer av Tg- anodalt respektive katodalt Tg- från pankreas till blod och urin hos patienter med AP kan användas för diagnostik av sjukdomen, och också försökt bedöma om Tg-nivåer kan vara till hjälp för att förutse svårighetsgraden av inflammationen. Femtio patienter varav 9 med svår AP undersöktes. Vi fann att koncentrationerna av anodalt Tg ökade mer än katodalt Tg i blodet samt att endast anodalt Tg kunde återfinnas i urinen. Vidare fann vi att koncentrationerna av anodalt Tg i urin var högre vid svår AP än vid mild emedan koncentrationerna i blod inte kunde skilja mellan de olika svårighetsgraderna. I arbete III har ytterligare undersökningar gjorts avseende tidig bedömning av inflammationens svårighetsgraden. I denna studie jämförde vi anodalt Tg och en markör för dess aktivering till trypsin- CAPAP (CAPAP= aktiveringspeptiden eller den sekvens av äggviteämne som spjälkas av från proenzymet vid aktivering till carboxypeptidas B, vilket är ett av pankreas proteinspjälkande enzym). Sextio patienter, i Malmö respektive Southampton, varav 12 med svår AP undersöktes avseende blod och urinnivåer av anodalt Tg och CAPAP. CAPAP i blod men speciellt i urin befanns kunna förutsäga svårighetsgraden med hög precision. Även anodalt Tg i urin visade högre koncentrationer vid svår respektive mild AP men skillnaderna var inte så påtagliga som för CAPAP. Delarbete IV syftade till att klarlägga inbördes tidsmässiga förhållanden mellan de olika inflammationsbefrämjande faktorerna vid AP. Detta gjordes genom att analysera blod respektive urin från 99 patienter som genomgick röntgenundersökning av gallvägar och bukspottkörtelgång, sk ERCP (endoskopisk retrograd cholangiopankreatografi). En känd möjlig komplikation till denna undersökning är AP varför denna undersökning kan användas som modell för att studera tidiga skeden av AP hos människa. Bland våra 99 patienter drabbades 14 av lindrig AP utan komplicerade förlopp. Resultaten av analyserna talar för att det tidigaste som sker vid AP av detta slag är ett läckage av Tg. Tolv till arton timmar senare kan aktivering av Tg, mätt som CAPAP i urinen, konstateras i de fall som drabbades av AP. Resultaten kan inte med säkerhet ge besked avseende de tidsmässiga förhållandena mellan ovanstående och nivåer av inflammationsbefrämjande cytokiner respektive aktiverade vita blodkroppar. För detta krävs ytterligare undersökningar. I arbete V syftade vi till att framställa en analysmetod för att mäta trypsinogenets aktiveringspeptid, TAP (jfr CAPAP) samt att beskriva vad som sker med denna avspjälkningsprodukt efter aktiveringen av Tg. En sk radioimmuno assay (analysmetod som bygger på användande av antikroppar och radioaktivt jod för mätning av koncentrationen av ett ämne som antikropparna är riktade mot) utvecklades för TAP. Vi kunde med hjälp av denna samt en kommersiellt tillgänglig TAP- analysmetod påvisa att TAP-reaktiviteten i urin utgörs av en del av de 8 aminosyrorna (äggvitebyggstenar) som TAP är uppbyggd av. En nedbrytning av TAP kunde visas ske tämligen snabbt i blod, vilket gör att tidpunkten för provtagningen vid användande av analysen blir kritisk eftersom TAP-aktiviteten minskar med tiden. Detta kan vara en delförklaring till varför TAP-analysmetoden förfaller fungera sämre vid svårighetsbedömning än CAPAP, som är en mer stabil peptid.



KONKLUSION Sammanfattningsvis visar våra resultat: * att fria syreradikalers verkan inne i pankreas celler har betydelse för senare läckage av Tg samt för dess aktivering, * att Tg-läckaget sker tidigare än aktiveringen av Tg vilket talar för att den dominerande aktiveringen sker utanför pankreascellerna, * att andra faktorer av betydelse för AP och dess förlopp inte kan påvisas föregå Tg-läckaget och ej heller trypsinogenets aktivering talande för att Tg och dess aktivering har en central roll i utvecklingen av AP, samt * att de lovande resultaten för CAPAP (markör för fritt trypsin) som metod för att förutsäga svårighetsgraden understryker denna centrala roll.

• author: Petersson, Ulf
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Löhr, Matthias, Medizinische klinik IV, Mannheim
• organization: Surgery (research group)
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Surgery
• keywords: TAP, ERCP, carboxypeptidase B activation peptide, trypsinogen activation peptide, trypsinogen activation, Acute pancreatitis, trypsinogen, CAPAP, Surgery, orthopaedics, traumatology, Kirurgi, ortopedi, traumatologi
• pages: 120 pages
• defense location: Department of Surgery, Malmö University Hospital, Entrance 42,
• defense date: 2001-05-25 13:00:00
• ISBN: 91-89625-01-3
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 17b3fa90-4e32-4d06-b9ea-f26964758c0b (old id 41604)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:55:20
• date last changed: 2018-11-21 21:01:35