Effects of dopamine and excitotoxicity in experimental models of Huntington's disease

Abstract

Huntington's disease (HD) is a hereditary neurodegenerative disorder caused by an expansion of a CAG repeat in the HD gene, that leads to dysfunction and death of striatal neurons. The pathogenetic mechanisms underlying HD are not known, but excitotoxicity and dopamine (DA) have been suggested to play a role. In this thesis, the effects of excitotoxicity and DA have been studied in striatal in vitro and in vivo models of HD.



I examined the effect of brain-derived neurotrophic factor and ciliary neurotrophic factor on excitotoxin- and DA-induced toxicity, as well as the mechanisms involved in cell death after increased intracellular calcium in striatal neurons. I showed that two transgenic HD mice with expanded CAG repeats in exon 1 of the HD gene (R6 mice) are completely resistant to intrastriatal injections of the excitotoxin quinolinic acid (QA). However, no change in susceptibility to QA was found in transgenic HD mice expressing a 3 kb part of the HD gene, regardless of repeat length and age. Interestingly, when studying the effect of DA on R6 mice, there was an age-dependent change in susceptibility to DA-mediated toxicity. Cultures of postnatal striatal R6 neurons exhibited an increased sensitivity to DA, more cell death, production of free radicals and formation of ubiquitinated aggregates in the cytosol compared to normal neurons. When DA was injected intrastriatally into R6/1 mice, they displayed a normal sensitivity to DA at 3 weeks of age, and a partial resistance at 16 weeks of age. At the time of resistance, dopaminergic neurons from R6 mice displayed reduced soma areas in the substantia nigra pars compacta, and decreased levels of DA both at baseline and after exposure to the DA-releasing agent malonate (using microdialysis), indicating an effect of the transgene on the nigrostriatal system in these mice. Exposure of striatal neurons from R6 mice to DA induced autophagy both in vitro and in vivo. The findings in this thesis point to an important role of DA and autophagy in HD pathogenesis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Denna avhandling handlar om en ärftlig hjärnsjukdom som heter Huntingtons sjukdom, eller danssjuka. Sjukdomen leder till personlighetsförändringar, ofrivilliga rörelser (som ser ut som om personen dansar) och demens. Personer som drabbas dör 15-20 år efter att symptomen har brutit ut, och en god behandling eller botemedel saknas. Sjukdomen orsakas av att Huntingtongenen stammar, det vill säga att visssa sekvenser upprepar sig, och ju mer de upprepar sig desto tidigare får man sjukdomen. Den stammande Huntingtongenen leder till en förändrad funktion och slutligen död av celler i ett område djupt inne i storhjärnan som heter striatum. Striatum är viktigt både för att utföra rörelser och för en del av tankeverksamheten. Det förändrade proteinet huntingtin uttrycks i de flesta cellerna i kroppen, men det är främst de i striatum som blir påverkade vid Huntingtons sjukdom. Man vet inte varför de striatala nervellerna är särskilt känsliga för det förändrade huntingtin proteinet och det är en av de stora gåtorna i Huntingtons sjukdom. Man tror att signalsubstanserna dopamin och glutamat har betydelse och eventuellt bidrager till celldöden. Striatum tar emot nervcellstrådar från hjärnbarken som innehåller glutamat. Det är bevisat att för stor mängd av glutamat leder till skada av nervcellerna (kallas för "stimuleringsskada" eller excitotoxicitet), och det har därför föreslagits att glutamat skulle kunna bidraga till sjukdomsutvecklingen vid Huntingtons sjukdom. Striatum tar också emot nervcellstrådar från ett annnat område i mellanhjärnan som heter den svarta substansen (substantia nigra) och som innehåller signalsubstansen dopamin. Det har visats att dopamin kan vara skadligt för striatala nervceller både i odlingar och i försöksdjur. I denna avhandling har jag därför undersökt effekterna av dopamin och excitotoxicitet i experimentella modeller av Huntingtons sjukdom. Jag började med att undersöka generella mekanismer som leder till nervcellsskada. Man vet att för höga nivåer av kalkjoner inne i cellerna spelar en central roll. Jag studerade vilka mekanismer som är involverade i att orsaka celldöd när striatala celler har förhöjda nivåer av kalkjoner. I striatala odlingar såg jag att detta ledde till en öppning av porer i cellernas energiavdelning (kallas för mitokondrier), aktivering av nedbrytande ämnen (kaspaser) och bildning av fria radikaler. Fria radikaler är molekyler som gärna reagerar med olika delar i cellerna och som därmed förstör deras uppbyggnad och funktion.



I striatala kulturer undersökte jag också effekten av faktorer som stödjer nervcellers överlevnad. Tillväxtfaktorn CNTF (ciliary neurotrophic factor) har föreslagits som en behandlingsmetod för Huntingtons sjukdom och kliniska prövingar med denna faktor pågår. Jag var intresserad av att se vilka mekansimer som ingår i dess skyddande funktion mot excitotoxicitet. Jag kunde visa att CNTF är skyddande mot excitotoxicitet på ett koncentrationsberoende sätt, och att dess funktion är beroende av bildning av nya proteiner. Jag undersökte hur tillväxtfaktorn BDNF (brain-derived neurotrophic factor) fungerar mot nervcellsskada som uppkommer till följd av att cellen utsatts för höga dopaminkoncentrationer. Det har nyligen visats att mängden BDNF är minskad i de nervcellstrådar som kommer till striatum i hjärnor från Huntington patienter, och det har spekulerats kring huruvida denna brist på tillväxtfaktor orsakar att cellerna inte fungerar och sedan dör i striatum. Jag har visat att BDNF förhindrar bildningen av fria radikaler och celldödsförändringar i cellernas kärnor, men att det inte hindrar cellerna från att dö.



För forskningen om Huntingtons sjukdom har produktionen av transgena möss som utgör modeller av sjukdomen spelat stor roll. Transgena möss har en specifik förändring i arvsanlaget; i detta fallet har de en del av Huntingtongenen från människa. Jag har använt mig av två typer av transgena möss i denna avhandling. En mus kallas för R6 och innehåller några få procent av den stammande Huntingtongenen, och den andra kallas för 3 kb och innehåller cirka en tredje del av den stammande Huntingtongenen. När jag odlade striatala nervceller från R6 musen såg jag att de överlevde lika bra som normala nervceller fram till 64 dagar i odling. Men när jag exponerade dem för skadliga mängder av dopamin så var R6 cellerna mer känsliga än celler från vanliga möss. Fler av R6 cellerna dog, och en större del av dem bildade fria radikaler och ansamlingar av proteiner. Dopamin inducerade också en celldödsprocess som heter autofagi i R6 nervcellerna. Autofagi innebär att cellerna bryter ner sig själva inifrån, antingen för att skydda sig själva mot något skadligt, eller för att långsamt dö. Jag injicerade sedan dopamin i striatum i vuxna R6 möss, och fann att de uppvisade en åldersberoende resistens mot dopaminskadan. Således var unga möss fortfarande känsliga för dopamin-inducerad skada, emedan de vid 2-4 månaders ålder uppvisade mycket små skador efter dopamin injektion. Tillsatsen av dopamin i R6 mössen gav upphov till autofagi. Jag undersökte också om R6 mössen hade en förändrad känslighet för excitotoxicitet genom att tillsätta ett glutamat-liknande ämne till striatum i R6 och normala möss. Jag såg att R6 mössen är helt resistenta mot celldöd inducerad av stimuleringsskada och att detta resistensfenomen inte tycks bero på en ökning av skyddande molekyler som antioxidanter och anti-celldöd proteiner. När jag tillsatte samma ämne till den andra typen av Huntingtonmöss, 3 kb mössen, så reagerade de likadant på de skadliga effekterna som normala möss, dvs de utvecklade inte ett ökat skydd mot experimentella hjärnskador. Det är oklart vad denna skillnad i känslighet för excitotoxicitet mellan de två typerna av transgena Huntington möss beror på.



Jag var också intresserad av att undersöka om den svarta substansen, som innehåller cellkropparna som tillverkar dopamin, är påverkad i Huntingtons sjukdom. Jag kunde se att även om inga celler hade dött i den svarta substansen i R6 mössen, så hade cellkropparna krympt till följd av Huntingtongenen. Deras nervcellstrådar till striatum fanns kvar så jag blev intresserade av att mäta om de kunde frisätta dopamin på ett normalt sätt. Därför placerade jag en tunn slang i striatum på mössen och mätte signalsubstanser i en koksaltslösning som fått passera genom slangen. I striatum på R6 möss var mängden frisatt dopamin krafigt reducerad jämfört med i normala möss. Jag tillsatte då ett ämne (malonat) som normalt leder till frisättning av dopamin, och i R6 mössen var frisättningen mycket mindre än i normala möss. Dessa fynd tyder på att den svarta substansens dopaminsystem är påverkat i Huntingtons sjukdom. Eftersom R6 mössen har visat sig vara resistenta mot ett antal ämnen vars skadlighet delvis beror på dopamin, så är det möjligt att de låga nivåerna av dopamin i R6 mössens striatum är involverade i resistens fenomenet. Resultaten från min avhandling stimulerar till vidare studier kring betydelsen av den svarta substansen, dopamin och de striatala cellernas autofagi för att kunna lösa den stammande genens gåta.

• author: Petersén, Åsa
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Young, Anne B, Dept. Neurology, Harvard Medical School, Boston, USA
• organization: Neurobiology (research group)
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurosciences
• keywords: Neurology, excitotoxicity, dopamine, Huntington's disease, striatum, neuropsychology, neurophysiology, Neurologi, neuropsykologi, neurofysiologi
• pages: 200 pages
• defense location: Segerfalksalen, WNC
• defense date: 2001-12-08 10:00:00
• ISBN: 91-628-5027-X
• language: English
• LU publication?: yes
• id: f1c796b5-80d9-4c31-bf36-5a674b8dd62e (old id 42071)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:18:51
• date last changed: 2018-11-21 21:10:13