Microrheology of Concentrated Protein Solutions

Abstract

The behavior of concentrated protein solutions is of general high interest due to implications in, for example, biological systems and medical applications. It is necessary to investigate the rheological properties of such systems to understand how parameters, such as stability, are affected by the high concentrations. Unfortunately, studies are often hindered by the lack of sufficient quantities of the protein of interest. A collection of techniques have been suggested as a way to circumvent this issue by requiring much smaller sample volumes. These techniques are commonly collated by the term "microrheology" and are based on observing the motion of tracer particles immersed in a sample.

This thesis describes the work of preparing tracer particles suitable for scattering- and microscopy-based microrheology of concentrated protein solutions. Different proteins were investigated using the aforementioned methods, including several present in the eye lens system which has a necessity of high protein concentrations to function optimally. Employing a secondary sample preparation step involving evaporation made it possible to reach into the arrested regime of close-packed proteins. Samples in this region are of high scientific interest but commonly difficult to produce and investigate.

Abstract (Swedish)

Tack vare ett näst intill oändligt antal variationer så har proteiner blivit naturens standardlösning för diverse uppgifter och problem. I våra egna kroppar har vi en uppsjö av olika varianter där några är allmänt välkända, t.ex. hemoglobin i våra röda blodkroppar som transporterar runt syre och insulin vilket sänker vår blodsockernivå. Andra proteiner är mer okända men trots det lika viktiga, exempelvis haptoglobin vars uppgift är att rensa bort hemoglobin som kommit på avvägar, samt glukagon som höjer vår blodsockernivå vid behov.

Ett annat användningsområde för proteiner är i ögats lins som innehåller extremt höga proteinkoncentrationer, faktiskt de högsta som vi har i kroppen. Just i linsen har naturen utnyttjat att en proteinlösning bryter ljus; ju högre koncentration desto starkare brytning vilket i våra ögon bidrar till att fokusera inkommande ljus på näthinnan så att vi kan se klart och tydligt. En effekt av de höga koncentrationerna är att interaktioner mellan proteiner leder till ökad viskositet, d.v.s. hela systemet blir mer trögflytande. Det är en viktig egenskap eftersom linsen måste kunna ändra form för att vi ska kunna fokusera på endera långt eller nära håll.

Normalt sett innehåller celler, förutom proteiner, ett stort antal olika komponenter men cellerna i ögats lins gör sig av med i princip alla extra komponenter under fosterutvecklingen. Detta är nödvändigt för att linsen ska vara genomskinlig, vi kan exempelvis inte se igenom vår hud p.g.a. allt som sprider och absorberar ljus. Det här har dock nackdelen att förmågan till att skapa nya proteiner också försvinner, vilket innebär att de ögonlinsproteiner vi har när vi föds är de vi behöver använda under resten av livet. Proteinerna i ögonlinsen måste därför vara stabila under hela vår livslängd vilket är extra problematiskt vid höga proteinkoncentrationer.

Det finns en reell risk, särskilt vid höga koncentrationer, att proteiner klumpar ihop sig och faller ur lösning vilket orsakar okontrollerad ljusspridning. Ifall det sker i tillräcklig omfattning i ögats lins kommer den inte längre att vara fullt genomskinlig och synen blir därmed oskarp. Det här är orsaken till sjukdomen grå starr vilken behandlas genom att kirurgiskt byta ut linsen mot en konstgjord variant. För att försöka förhindra sådana problem finns det gott om speciella skyddsproteiner i ögats lins vars uppgift är att hålla de andra proteinerna stabila. En annan vanlig, men mindre dramatisk, åkomma är ålderssynthet som gör att vi får svårt att fokusera på saker nära oss, såsom texten i vår favoritbok. Det beror på att linsen blir mer trögflytande med åldern och inte längre kan ändra sin form lika effektivt, vilket ofta kan kompenseras genom användandet av läsglasögon men kan även behandlas kirurgiskt likt andra synkorrigeringsoperationer.

Det finns metoder, vilka gemensamt går under namnet reologi, som används för att studera just sådana materialförändringar som resulterar i exempelvis ändrad viskositet. Ett stort problem vid reologiska studier av proteinsystem, som det i ögats lins men även för vissa proteinbaserade mediciner, är att experimenten behöver utföras vid de höga koncentrationer som de normalt sett finns i för att ge tillförlitliga svar. Framställning av tillräckliga mängder protein för att nå höga koncentrationer är ofta ett dyrt och tidskrävande åtagande varför man gärna vill utnyttja tekniker som klarar av små mätvolymer.

En speciell kategori av reologiska tekniker som endast behöver små volymer är mikroreologi. De utmärker sig genom att man tillsätter små nano/mikrometer-partiklar i proverna och sedan studerar hur dessa rör sig för att på så sätt få fram information om provet som helhet. Det är exempelvis möjligt att bestämma viskositeten av ett prov utifrån hur partiklarnas spontana, slumpmässiga rörelser påverkas av olika proteinkoncentrationer. För att sådana mätningar ska vara tillförlitliga är det viktigt att de tillsatta partiklarna inte har några märkbara interaktioner med vare sig varandra eller proteinerna.

Den här avhandlingen beskriver forskning centrerat kring partiklar som är behandlade just för att inte interagera med sin omgivning. De har sedan använts för att undersöka olika proteiner, däribland några av de som finns i ögats lins, i mikroreologiska experiment baserade på ljusspridning och mikroskopi. En kombination av olika metoder möjliggjorde förberedandet av de höga proteinkoncentrationer som finns i ögats lins fast i mikrolitervolymer. Den här metodiken kan även användas för att studera andra system där man är intresserad av de höga koncentrationer då ett system har så pass hög viskositet att det inte längre kan beskrivas som ett flytande material.

• author: Garting, Tommy
• supervisor: Anna Stradner; Ulf Olsson
• opponent: Professor Frank Scheffold, University of Fribourg, Switzerland
• organization: Physical Chemistry
• publishing date: 2019-01
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Physical Chemistry
• keywords: Microrheology, Dynamic Light Scattering, Protein, Pegylation, Viscosity
• pages: 151 pages
• defense location: Sal C, Kemicentrum, Naturvetarvägen 14, Lund
• defense date: 2019-02-22 13:15:00
• ISBN: 978-91-7422-624-9
• ISBN: 978-91-7422-625-6
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 4b222388-a7b6-42de-b195-4e3b653be572
• date added to LUP: 2019-01-28 09:15:00
• date last changed: 2022-06-15 09:46:12