RECOMBINANT PEROXIDASES AND XYLANASES: I. Cloning and production of a peroxidase from horseradish II. Characterisation of functional domains of thermostable xylanases from Rhodothermus marinus

Abstract

Part I: Plant peroxidases are useful in many areas of application e.g. as tracer enzymes for clinical applications and in biosensors as well as for industrial purposes like in waste water treatment and bleaching processes. A gene encoding a new, neutral horseradish peroxidase isoenzyme, HRP-n, was isolated. The encoded protein shows only 50% sequence identity with the classical HRP-C and lacks the C-terminal propeptide found in HRP-C. The cDNA encoding HRP-n was expressed in <i>Escherichia coli</i> but was found to be growth inhibiting and under certain circumstances also toxic. HRP-n was then successfully produced in the Baculovirus/insect cell system. Preliminary results indicate that HRP-n differs from the classical HRP-C with regard to catalytic properties. Differences between HRP-n and HRP-C are found in the peripheral Phe residues which are reported to guard the entrance to the exposed heme, suggesting difference in their properties with respect to substrate specificity.



Part II: Xylanases are enzymes involved in plant cell wall hydrolysis. Many of them have a modular structure, with functional domains separated by linker sequences. The most common domains are the catalytic domains (CDs), and the cellulose or carbohydrate binding domains (CBDs). CBDs are proposed to enhance the efficiency of hydrolysis of crystalline and complex substrates. Xylanases have a recognised potential as modifying enzymes in the pulp and paper, food and feed, and textile industries. Some of these processes are harsh and require robust enzymes that can withstand both high temperatures and extremes of pH. Such requirements can be fulfilled by enzymes from thermophiles. The <i>xyn1</i> encoded xylanase (Xyn1) from the thermophilic bacterium <i>Rhodothermus marinus</i>, is a modular multidomain enzyme, containing two putative CBDs repeated in tandem. The full length xylanase and the two CBDs were produced separately in <i>E. coli</i> and were subsequently characterised. Our results show that Xyn1 represents a new, unique combination of thermostable binding domains, classified into CBD family IV, with affinity for xylan, in addition to amorphous cellulose and soluble glycans.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Till alla de som har undrat vad det är som jag har hållit på med under alla dessa år men inte vågat att fråga.



Jag har arbetat med kloning av gener som kodar för olika enzymer. Enzymer finns i alla levande celler och fungerar som katalysatorer (hjälpare) i olika biokemiska reaktioner. Deras uppgift är att påskynda reaktionshastigheten utan att själva förbrukas i reaktionen och alla enzymer har sin speciella funktion i cellen. Varje enzym motsvaras av en gen, del av arvsmassan, som utgör själva ”ritningen” för det enzym som det kodar för.



Förutom att enzymer uppfyller sina naturliga uppgifter i cellen kan de också vara intressanta för användning i olika analytiska och industriella processer. Man kan rena fram enzymer från cellerna för att sedan använda dem som tillsatser i tvättmedel, pappersblekning m.m.. Oftast behövs det stora mängder av enzymet och ibland ställs det höga krav på att de är rena, krav som ibland kan vara svåra att uppfylla. Då kan det vara en fördel att klona genen för det aktuella enzymet och låta en högproducerande mikroorganism ta hand om tillverkningen. Det blir då också lättare att rena upp enzymet.



Kloning innebär att man ”klipper ut” den aktuella genen från den ursprungliga värden, flyttar över den i en ny värdorganism och låter denna att massproducera det främmande enzymet. Den mest använda organismen för sådana ändamål är en ”laboratoriesläkting” till den vanliga tarmbakterien <i>Escherichia coli,</i> den klassiska ”arbetshästen”, som har förmågan att föröka sig i mycket snabb takt och producera stora mängder av det främmande enzymet.



De enzymer som jag har arbetat med är peroxidas respektive xylanas. Det är två helt olika enzymer med helt olika ursprung.



Peroxidaser finns i alla levande celler och det peroxidas som jag har arbetat med kommer från pepparrot. Pepparrotsperoxidasets naturliga funktion är bl.a. att ingå i växtens försvar mot parasitangrepp och andra sorters stress så som kyla, luftföroreningar, m.m. Man vet också att de deltar i regleringen av växtens tillväxt. Peroxidaser används idag i en mängd olika kliniska och industriella sammanhang. De ingår t. ex. i de s.k. ”glukosstickor” som används av bl.a. diabetiker för att mäta socker i urinen. När det finns socker så ändrar stickan färg, ju mer socker desto större färgomslag.



Min uppgift har varit att isolera genen för peroxidas från pepparrot och sedan hitta en lämplig värdorganism för att kunna producera peroxidaset i stor skala. Jag lyckades att isolera en gen som kodar för ett peroxidas som skiljer sig något från det vanligen använda peroxidaset med avseende på dess aminosyrasammansättning, d.v.s. de ingående byggstenarna. Jag provade att producera enzymet i den klassiska arbetshästen <i>Escherichia coli</i> men enzymet visade sig vara giftigt för bakterien. Det system som har visat sig vara bäst lämpat för produktion av ”mitt” peroxidas bygger på kloning och produktion i insektsceller.



Vi har fått resultat som tyder på att det nya peroxidaset har något annorlunda egenskaper än det vanligen använda peroxidaset. I dag finns det ett stort intresse för att utveckla nya peroxidasbaserade mätmetoder och processer och det nya peroxidaset borde vara en intressant kandidat för sådana ändamål.



Xylanas är det andra enzymet som jag har arbetat med. Xylanaser bryter ner xylan som finns i ved. Xylanaser har visat sig intressanta i pappersblekningssammanhang där de utgör ett miljövänligt alternativ till det giftiga kloret.



Ved består i huvudsak av cellulosa, olika hemicellulosor, bl.a. xylan, och lignin. Det är ligninet som gör att oblekt papper är brunt. Det mesta av ligninet försvinner vid kokning av pappersmassan men för att få vitt papper av hög kvalitet måste det resterande ligninet tas bort med olika blekningsmetoder. Klorgas är den effektivaste kemikalien men också den giftigaste. Andra kemikalier som också kan användas är klordioxid, syrgas, ozon och väteperoxid. Om man förbehandlare massan med xylanaser kan mera av ligninet tvättas bort och mängden klor i blekningsprocessen kan minskas eller helt tas bort.



Efter kokningen är temperaturen hög i pappersmassan och ”vanliga” enzymer förstörs. Det är därför en stor fördel att använda värmestabila enzymer. Termofila (värmeälskande) bakterier producerar värmestabila enzymer. Xylanaset som jag har arbetat med produceras naturligt av en termofil bakterie som heter <i>Rhodothermus marinus</i> och som lever i marina varma källor. Just den här bakterien isolerades från en varm källa strax utanför Islands nordvästra kust.



Nackdelen med <i>Rhodothermus marinus</i> är att den producera xylanas i alldeles för låga mängder. Vi har därför klippt ut och fört över genen som kodar för xylanas från <i>Rhodothermus marinus</i> till <i>Escherichia coli</i> och låtit den producera xylanaset i stora mängder.



Enzymer som xylanaser, som har till uppgift att bryta ner stora polymerer (som xylan) till små beståndsdelar är oftast uppbyggda av flera olika delar, s.k. domäner. Dessa domäner har specifika funktioner. Vi har funnit att vårt xylanas består bl.a. av en katalytisk domän vars uppgift är att sköta själva nedbrytningen och en bindande domän som hjälper till att förankra enzymet vid polymeren och på så sätt göra nedbrytningen effektivare.



Min uppgift i det här projektet har varit att klona dessa bindande domäner och studera deras bindningsegenskaper. Meningen är att vi skall se om de bindande domänerna kan göra nedbrytningen av xylan effektivare när man bleker papper.

• author: Bartonek Roxå, Eva
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Kristjansson, Jakob K., IceTec, Reykjavik, Iceland
• organization: Biotechnology
• publishing date: 1998
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Industrial Biotechnology
• keywords: amorphous cellulose, xylan, CBD, carbohydrate binding domains, insect cells, Baculovirus, catalytically active, recombinant horseradish peroxidase, HRP-n, PASC, beta-glucan, Biotechnology, Bioteknik
• pages: 152 pages
• defense location: Lecture hall K:C, Center for Chemistry and Chemical Engineering
• defense date: 1998-11-19 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUTKDH/TKBT--98/1039--SE
• language: English
• LU publication?: yes
• id: e675c953-8380-47f7-ac21-6b836a0b23ce (old id 39080)
• date added to LUP: 2016-04-04 13:11:49
• date last changed: 2018-11-21 21:12:38