Evaluation of Lipases for Enzymatic Catalysis of Vegetable Oils and Fats

Abstract (Swedish)

Som en del i utvecklingen mot grönare och miljövänligare processer, samt ett behov av ytterst specifika reaktioner, vill AAK AB utvidga sin användning av lipaser i sin produktion av strukturerade triacylglyceroler (STAGs). AAK vill bygga upp ett bibliotek av utvärderade lipaser. Syftet med detta examensarbete är att bidra till detta bibliotek genom att karakterisera en grupp kommersiellt tillgängliga lipaser. Beskrivningen av lipaserna innehåller deras ursprung, GMO status, möjliga reaktioner, temperatur- och pH intervall, samt specificitet mot kolkedjelängd och mättnad på fettsyror. Lipasernas specificitet bestämdes experimentellt i detta examensarbete medan de andra parametrarna i biblioteket bestämdes genom litteraturstudier.

För att bestämma lipasernas specificitet utfördes transesterifieringsreaktioner på fettsyraestrar av olika längd där produktkoncentrationen sedan analyserades med gaskromatografi. Från bildningen av produkt över tid kunde sedan lipasernas transesterifieringsaktivitet bestämmas och jämföras. Substraten som användes i detta examensarbete varierade från 4 till 18 kol långa fettsyraestrar och inkluderade både mättade och omättade fettsyror. Lipasernas aktivitet undersöktes på både rena substrat och en mix av alla substraten.

Resultaten visade på att X1, Y2 och Y3 hade bäst aktivitet på korta fettsyror, medan kontrollenzymerna TL och TL IM hade högst aktivitet på medellånga fettsyror. Y1 visade sig fungera bäst på både medellånga och långa fettsyror, dock så hade Y1 samt TL och TL IM relativt hög aktivitet på alla substrat. Undersökningen gällande preferens för mättade eller omättade fettsyror visade att X1 och Y2 hade bättre aktivitet på omättade fettsyror medan X2, TL och TL IM föredrog mättade fettsyror. Y1 i sin tur visade liknande aktivitet på de mättade och omättade fettsyrorna. Inga slutsatser kunde dras för vilken kolkedjelängd som X2 föredrog eller om mättade eller omättade fettsyror föredrogs av Y3, detta berodde på mätosäkerhet i datan.

Abstract

As part of a switch towards more green and environmentally friendly processes, together with a need for highly specific reactions, AAK AB wants to broaden their use of lipases in the production of structured triacylglycerols (STAGs). AAK are working on creating a lipase library where several lipases are evaluated, this master thesis aims to contribute to this lipase library by characterizing a selection of commercially available lipases. The description of the lipases contains their origin, GMO-status, possible reactions, temperature- and pH range, and specificity towards fatty acid chain length and saturation. The specificity of the lipases was studied experimentally in this thesis while the other parameters in the library were determined by literature studies.

To determine the specificity of the lipases, transesterification reactions were carried out on fatty acid esters and the change in product concentrations with time were measured by gas chromatography. From the product formation rate, the transesterification activities could be estimated and compared. The substrates used in this thesis ranged from 4 to 18 carbons long fatty acid esters (FAEs) and included both unsaturated and saturated FAEs. The activity of each lipase was investigated in two different situations, both on pure substrates and on a mixture of all substrates.

The results showed that X1, Y2 and Y3 had the best activity on short chain fatty acids (SCFAs), while the control lipases TL and TL IM were concluded to have the highest activity on medium chain fatty acids (MCFAs). Y1 showed the highest activity on both medium chain- and long chain fatty acids, however, Y1, TL and TL IM had relatively high activities on all substrates. Looking at saturated- versus unsaturated fatty acids, it was shown that X1 and Y2 had higher activity on a monounsaturated fatty acid (MUFA), while X2, TL and TL IM preferred saturated fatty acids (SFAs). Y1 showed equal specificity towards SFAs and MUFAs. No conclusion could be made for the preference of carbon chain length for X2 or the preference of SFAs versus MUFAs for Y3 due to uncertainties in the data.

Popular Abstract (Swedish)

Enzymer för en grönare och mer effektiv tillverkning av vegetabiliska oljor och fetter.

Fett är en vanlig komponent i mängder av produkter, både naturligt förekommande och tillsatt. I kroppen är fett viktigt för normal funktion då det används som energi, men även funktioner som uppbyggnad och reparation av celler, tillverkning av hormoner och upptag av fettlösliga vitaminer kräver fett. En del fetter är till och med essentiella, alltså livsnödvändiga att få i sig via kosten eftersom vi inte kan tillverka dem själva i kroppen. Fett associeras ofta med mat och hälsa, men fett är också en viktig beståndsdel i produkter såsom kosmetika, hudvård och värmeljus.

Beroende på användningsområdet för fetter så är olika egenskaper önskvärda. Inom chokladtillverkning vill man ha ett fett som smälter i munnen, medan man för modersmjölksersättning vill ha ett högt näringsvärde. Huvuddelen av fett består av triacylglyceroler, vilket är tre fettsyror som är kopplade till en glycerolmolekyl. Egenskaperna hos ett fett styrs av kompositionen av fettsyrorna och deras positioner på glycerolmolekylen. Kompositionen kan varieras med olika längd och mättade eller omättade fettsyror. Positionen för fettsyrorna kan variera mellan den inre positionen och de två yttre positionerna på glycerolmolekylen. Ett sätt att framställa fett med önskade egenskaper är att modifiera naturligt förekommande fetter med enzymer. Enzymer är protein som snabbar kemiska reaktioner utan att själva förbrukas. De kan liknas vid kockar som använder ingredienser för att skapa en önskad produkt. Enzymer fungerar olika bra med olika substrat, eller ingredienser, och det gäller att hitta ett enzym som passar för ändamålet. Detta examensarbete har gjorts i samarbete med AAK AB och fokuserar på att utvärdera en grupp enzymer för att ta reda på dess möjliga användningsområden och på så sätt lägga grunden till ett enzymbibliotek.

En viktig aspekt gällande användning av enzymer är att de är olösliga i oljor och fetter, de kommer därför att klumpa ihop sig om de är fria. En vanligt förekommande lösning är att fästa enzymerna på ett bärarmaterial, en process som kallas immobilisering. Immobilisering av enzymerna kommer även möjliggöra återanvändning av enzymerna, då de enklare kan separeras från oljan. I detta projekt immobiliserades enzymerna på en porös, tvättsvampsliknande plast innan de användes till de önskade reaktionerna. Enzymerna utvärderades på fem olika substrat med varierande storlek och form. Enzymernas aktivitet mättes på de enskilda substraten, men även på en mix av alla substrat. Detta gjordes för att kunna observera skillnader hos enzymerna mellan en kompetitiv och icke kompetitiv miljö.

I undersökningen utvärderas fem kommersiella enzymer, samt två kontrollenzym för att säkerställa att metoden fungerar. Resultaten visade att X1, Y2 och Y3 fungerade bäst på korta fettsyror. Kontrollenzymerna TL och TL IM, samt Y1, visade sig föredra medellånga fettsyror, men fungerar även bra på övriga fettsyror. Ingen slutsats kring X2 och dess preferens kunde dras på grund av stora variationer i mätningarna. Utöver resultaten för enzymerna så är även det utvecklade protokollet för undersökning av fettsyrapreferens ett viktigt resultat för framtida undersökningar. Förhoppningen är att AAK AB i framtiden kan använda detta arbete för att bygga ut enzymbiblioteket med fler intressanta enzym.

• author: Andersson, Oliver and Pradon, Hampus
• supervisor: Carl Grey; Ariana Causevic
• organization: Biotechnology; Biotechnology (MSc)
• course: KBTM05 20241
• year: 2024
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: Enzyme, lipase, transesterification, biotechnology
• language: English
• id: 9157235
• date added to LUP: 2024-06-11 08:27:20
• date last changed: 2024-06-11 08:27:20