Sensitive Detection of Blood Biomarker Pentraxin 3 – Development and Comparison of Amperometric and Capacitive Biosensors in Flow-Injection Systems

Abstract

Within clinical diagnostics there is always a need for innovative methods that are rapid, sensitive, and more accurate. In this study two bioanalytical systems have been evaluated for pentraxin 3 (PTX3) detection. PTX3 is a blood biomarker involved in the native immune system that can indicate sepsis, a disease that currently lacks a fast and sensitive analytical method for early detection. Currently, a whole panel of tests supported by physical symptoms is used, and diagnosis can only be confirmed several days after the blood sample is taken. PTX3 can also indicate other diseases such as covid 19 and some types of cancer. The analytical platforms in this work all utilizes immobilized anti-PTX3 antibodies immobilized on an electropolymerized gold working electrode in combination with flow-injection analysis (FIA) to control the injections into a flow-cell with a three-electrode system. The first method used capacitance measurements and the results indicate that there is binding for PTX3 concentrations as low as 10-20 M in buffer. The second system utilizes amperometric measurements and results points towards binding at concentrations of 10-12 M of PTX3. Additionally, a capacitive model system with Protein G (PG) as an immobilized biorecognition element produced a clear signal when injecting 10-13 M antibodies as a target.

Popular Abstract (Swedish)

Mänskligheten strävar ständigt efter att utvecklas och bota olika typer av sjukdomar har varit ett prioriterat område i många hundra år. Idag har vi kommit långt, med många typer av olika antibiotika, målsökande terapier och vaccin. Men för att effektivt kunna behandla sjukdomar krävs att rätt diagnos ställs tidigt.
I detta examensarbete har jag utvecklat känsliga analysmetoder som kan ligga till grund för framtida klinisk diagnostik för tidig detektion av framför allt blodförgiftning (sepsis) men även andra sjukdomar som covid 19 och vissa typer av cancer.
För att kunna upptäcka en sjukdom eller infektion i kroppen krävs att man letar efter något som utmärker sjukdomen från allt annat, en så kallad biomarkör. I detta fall så har jag fokuserat på detektion av en biomarkör som heter pentraxin 3 eller PTX3. PTX3 produceras i kroppen som svar på vissa typer av infektioner och hjälper till att hitta den infekterande organismen och aktivera immunförsvaret i en tidig fas. Normalt sett finns PTX3 i låga nivåer i blodet, oftast under tre nanogram per milliliter, men nivåerna kan öka nästan 1000-faldigt vid en akut infektion. Att leta efter en så lien mängd är ungefärligt jämförbart med att leta efter en droppe i en simbassäng som är 50x25m.
För att hitta så små koncentrationer av PTX3 krävs ett väldigt känsligt analyssystem som kan fånga in och mäta mängden. Till detta så används en elektrod med en guldyta som täckts av ett mycket tunt lager av antikroppar, kroppens bästa målsökarmolekyler. Antikroppar har en extremt bra förmåga att binda starkt och specifikt till målmolekyler (antigen), alltså i detta fall bara precis den biomarkören vi söker, PTX3, och hålla kvar den tills vi hunnit mäta hur mycket som finns i provet.
Att arbeta i en så liten skala gör att det krävs mycket känsliga mätmetoder och precisa injektionssystem. Jag använder i detta arbete ett flödesinjektions system (flow-injection analysis, förkortat: FIA) för att precist styra vilka volymer och flöden (mikroliter per sekund) som används. För att mäta mängden PTX3 så används två elektrokemiska mätmetoder som inte använts för denna biomarkör förut. Amperometrisk mätning som mäter hur mycket ström som kan passera ytan när man lägger på en bestämd spänning, och kapacitiv mätning som analyserar hur mycket ytan kan laddas upp, ungefär som ett pyttelitet batteri.
Resultaten i detta arbete tyder på att PTX3 binder till antikropparna på elektroden i kapacitiva systemet dessutom binder PTX3 hårt och är svårt att få loss så man inte kan mäta flera prov på samma elektrod. Dock så syns en inbindning även vid extremt låga koncentrationer vilket gör att man med ett optimerat system skulle kunna använda mycket små provvolymer och därmed späda bort mycket av det som stör analysen, d.v.s. annat som finns i t.ex. blodprov. Det amperometriska systemet är känsligt och verkar inte ha problem med stark inbindning och visar tecken på att det skulle kunna vara möjligt att mäta PTX3 i olika mängder.
Denna studie ska ses som ett första steg för dessa två metoder att kunna bli applicerbara i en klinisk miljö. Det finns mycket arbete kvar för att förbättra signaler och visa med hög säkerhet att det bara är PTX3 som binder, och att man kan göra kvantitativ (bedöma hur mycket) analys.

• author: Johansson, Viktor
• supervisor: Martin Hedström
• organization: Biotechnology; Biotechnology (MSc)
• course: KBTM05 20231
• year: 2023
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Medicine and Health Sciences; Biology and Life Sciences; Technology and Engineering
• keywords: Bioanalysis, Pentraxin 3, PTX3, FIA, Flow-injection analysis, Sepis, Electopolymerization, Self-assembling monolayer, Amperometry, Capacitance, Biotechnology
• language: English
• id: 9137116
• date added to LUP: 2023-09-15 11:59:10
• date last changed: 2024-02-15 10:20:05