Development of a high-throughput screening Queso Fresco model for evaluating antimicrobials

Abstract

Listeria monocytogenes is a pathogen, sometimes occurring in fresh cheese, such as Queso Fresco. Antimicrobials could be utilized to prevent the presence of L. monocytogenes in this type of cheese. In order to be able to screen and assess several novel antimicrobials simultaneously in the future, the validated miniaturized laboratory-scale model for Queso Fresco (MLQF) was further developed into a high-throughput screening model (HTQF). This included studying and comparing the microbial behavior of L. monocytogenes 10403S (LM), L. monocytogenes 10403S expressing GFP (LM-GFP), and a cocktail of five L. monocytogenes (LM-COCKTAIL). Additionally, analysis of luminescent bacteria (LUX) was also part of the study, however, not luminescent L. monocytogenes. LM-GFP and LUX was studied due to their light-emitting properties, which enables an efficient screening with a fluorometer instead of performing time consuming plating. In the HTQF, the Queso Fresco was produced in 96-well microplates, with a size of 0.05 ± 0.0004 g/cheese.

The strains and the model were evaluated with three different antimicrobial treatments; Lauric arginate, Ɛ-polylysine and a combination of these two. The aim for the combination of the antimicrobials was to have a variety in order to be able to see if the method is applicable in different scenarios. Preferably one antimicrobial without effect, one bacteriostatic, and a combination.

The result showed that the engineered LM-GFP had similar growth behavior as the parental strain. This was true both with and without treatments. They both grew 4 log CFU/g under no antimicrobial treatment for 28 days. The LM-COCKTAIL was comparable to these two for the control cheese (no treatment), with a growth of 4 log CFU/g and for one out of three treatments (lauric arginate), also for 28 days. The microbial behavior of the LM-COCKTAIL in the Queso Fresco produced in 96-well microplates needs further investigation in order to conclude its correlation to the other L. monocytogenes strains in this model. The fluorescence measurements with the LM-GFP gave a result which was difficult to correlate to the viable count (VC) of the same strain. However, the emitted light and the VC from the LUX suggested a better correlation.

In conclusion, based on the comparison of the result from the LM-GFP and the LUX, the luminescent reporter system seems to be preferable to the fluorescent in this HTQF model.

Popular Abstract (Swedish)

Utveckling av en modell för att öka
livsmedelssäkerheten för mexikansk färskost

Då säkerheten av livsmedel är väldigt viktig för alla individer, försöker industrin och forskare alltid hitta nya lösningar för att öka livsmedelssäkerheten. Hur kan man enkelt kolla flera konserveringsmedel samtidigt? Hur kontrollerar man att de fungerar? De här frågorna kan besvaras genom att studera hur bakterien Listeria monocytogenes kan överleva och växa i den mexikanska osten Queso Fresco. I den här studien har detta undersökts mer specifikt genom att använda en variant av bakterien Listeria som kan avge ljus. Det gör att det blir både snabbare och lättare att mäta om den finns och växer i osten.

L. monocytogenes är en patogen, vilket innebär att den är sjukdomsframkallande. I synnerhet är den här bakterien extra farlig för gravida, äldre och andra personer med nedsatt immunförsvar. Sjukdomen kallas listerios och för riskgruppen innebär det en dödlighet mellan 20-30%. Då Listeria kan växa även under kylda förhållanden likt de vi har i vårt kylskåp är den ett extra stort hot för livsmedel och dess konsumenter. Den mexikanska osten Queso Frescos egenskaper är dessutom passande för att Listeria ska trivas och frodas. Därför är det viktigt att försöka hitta konserveringsmedel som kan tillsättas för att hindra den här tillväxten och förebygga att människor utsätts för risken att bli drabbade.

För att kunna iscensätta ett verkligt scenario i osten, har en modell tagits fram för att utvärdera påverkan av L. monocytogenes av olika konserveringsmedel. Olika stammar av bakterien har utvärderats för att kunna jämföra om de beter sig likvärdigt i modellen. I modellen används Queso Fresco som tillverkats i miniformat, i storlek av 0,05 g per ost. De olika Listeria som jämförs är en ursprunglig moderstam, en modifierad version av moderstammen med en gen som avger ljus, samt en blandning av andra Listeria, isolerade från livsmedelsutbrott.

Studien visar att moderstammen och den modifierade stammen beter sig liknande, vilket är användbar information. Det betyder att den modifierade Listerian fördelaktigt kan användas i modellen, och ge ett resultat som är direkt jämförbart med liknande experiment med moderstammen. Däremot finns där fortfarande utmaningar med att genomföra analyser med den modifierade bakterien. Det handlar om att den mäts i en så kallad fluorometer, där det inte är optimalt att använda livsmedel vid mätningar. Vanligtvis utförs mätningarna i en homogen lösning, och inte med komplexa livsmedel. Ostens färg, sammansättning och oregelbundna form stör mätningarna och gör det svårt att utläsa ett resultat. Två olika sätt att avge ljus analyserades, så kallade luminescens och fluorescens.
Det som skiljer de båda åt är främst att fluorescens uppstår när bakterien utsätt för ljus. Luminescens är automatiskt, och ingen ljuskälla är inblandad för att ge upphov till ljus. De här två har olika sätten visade sig ge olika resultat. Den mest lovande verkar vara luminescens.
Kunskapen från den här studien har lett till en ökad förståelse av hur väl den här modellen fungerar, hur de olika stammarna är jämförbara, samt vilka begränsningar som kan utvärderas för att förbättra framtida forskning om hur man kan kontroller Listeria i mexikansk ost.

• author: Östberg, Jonna
• supervisor: Jenny Schelin; Michael Miller
• organization: Applied Microbiology
• alternative title: Utveckling av en high-throughput screening modell för Queso Fresco och utvärdering av antimikrobiella medel
• course: KMBM05 20181
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Agriculture and Food Sciences; Technology and Engineering
• keywords: Queso Fresco, Listeria monocytogenes, fluorescence, luminescence, antimicrobial, applied microbiology, teknisk mikrobiologi
• language: English
• id: 8949163
• date added to LUP: 2018-08-21 14:39:11
• date last changed: 2018-08-21 14:39:11