Optimization of Lipid Nanoparticle (LNP) Synthesis and Stability: Characterization of Model System and PolyA-Loaded MC3-LNPs

Abstract

Lipid nanoparticles (LNPs) are vesicular structures composed of phospholipids commonly used in vaccine formulations due to their ability to protect and encapsulate mRNA for efficient delivery to target cells. This delivery system was pivotal for the rapid development of COVID-19 mRNA vaccines. Efficient mRNA delivery depends on the particle size and stability of LNPs, making these key parameters to optimize.

This thesis comprises two experimental studies. The first study focused on synthesizing simplified LNPs and characterizing potential bleb structures. Dispersions of soy lecithin in Milli-Q water and emulsion in Miglyol oil were extruded, with particle size and stability monitored over one week using dynamic light scattering (DLS). The most stable LNPs were further analysed using asymmetric flow field flow fractionation (AF4) with riboflavin as a fluorescent marker to assess bleb formation.

The second study investigated MC3-LNPs, composed of D-Lin-MC3-DMA, DSPC,
cholesterol, and DMG-PEG-2000, encapsulating PolyA as mRNA. These particles were
produced via microfluidization in collaboration with the University of Copenhagen
(KU), Department of Pharmacy. While the size-fraction characterization via AF4 and
LC-CAD was limited by instrumental constraints, PolyA leakage was monitored under
both incubation at 37 ◦C and repeated freeze-thaw cycles using dual-wavelength UV
detection.

Results demonstrated that simplified LNPs dispersed in Milli-Q water at 50 ◦C exhibited the highest stability with a narrow size distribution, with an average particle diameter of ∼ 100 nm. However, the riboflavin labelling required further optimization to enable effective bleb characterization. For MC3-LNPs, PolyA content gradually decreased over time under both incubation at 37 ◦C and repeated freeze-thaw cycles, potentially due to leakage rather than structural degradation.

These findings provide insights into LNP stability and methodological approaches for their characterization, supporting the development of next-generation mRNA vaccines with improved robustness and delivery efficiency.

Popular Abstract (Swedish)

Under uppsvinget av corona pandemin år 2020 läarde vi att anpassa oss till förändrade förutsättningar i samhället till större grad än tidigare. Forskare och företag världen
över samarbetade för att utveckla och producera ett vaccin som skulle minska spridningen av viruset. Idag är denna pandemin nästan ett minne blott tack vare messengerRNA (mRNA)-vaccin, som har revolutionerat leverandet av mRNA inom medicin. Men forskningen kring effektivare leveranssytem av andra typer av mRNA-vaccin fortsätter.

År 2023 tillägnades Nobelpriset i fysiologi eller medicin till Katalin Karikó och Drew Weissman för deras arbete med utvecklingen av en ny mRNA-teknik, vilket möjliggjorde snabbare produktion av mRNA-vaccin mot COVID-19. Denna teknik, som fräömst fokuserar på mRNA-tillverkning, kommer troligtvis i framtiden även användas för utveckling av nya vaccin och läkemedel mot andra sjukdomar. Ett mRNA-vaccin består vanligen av mRNA inkapslat i nanobubblor av fettmolekyler, så kallade lipida nanopartiklar (LNPs). Dessa nanopartiklar transporterar mRNA till målcellerna för upptag, varefter det levererade mRNA inuti cellen styr tillverkningen av proteiner specifika för ett virus. Detta aktiverar immunförsvaret till att bilda antikroppar mot viruset. Dock har mRNA-vaccin visats vara ostabilt vid mekanisk stress och kan undergå nedbrytning över tid, vilket leder till minskad effektivitet av vaccinet. Det är
därmed av stort intresse för forskare och företag att öka stabiliteten hos mRNA-vaccin både under förvaring samt under cirkulationen i kroppen. Detta kan uppnås genom en förbättrad förståelse och optimering av LNP-komponenterna.

Detta arbetet fokuserar på stabilitet och optimering av de lipida nanopartiklarna som bär mRNAt till målcellerna, än på mRNA i sig. Syftet är att bidra till framtida utveckling av mRNA-vaccin som är stabilare och träffsäkrare på att leverera mRNA till målceller. Arbetet utfördes genom att tillverka lipida nanopartiklar med olika komponenter och studera bildningen av oregelbundna ytstrukturer, s.k. blebs, genom tillsats av vitamin B2 som en fluorescerande markör. Parallellt tillverkades MC3-LNPs, med samma komponenter som i Pfizer-BionTech COVID-19 vaccin, för att studera läckage av mRNA varianten PolyA. Framtida forskningstudier bör optimera metodiken att studera bleb-bildningen med hjälp av vitamin B2 för att säkrare kunna bestämma och karaktärisera deras förekomster. Dessutom bör vidare forskning undersöka hur LNP-komponenterna förändras ¨over tid under förvaring samt hur partikelstorleken påverkar
stabilitet och leveransförmåga.

• author: Begander, Hanna and Hot, Frida
• supervisor: Lars Nilsson
• organization: Food Technology and Nutrition (M.Sc.); Biotechnology (MSc); Biotechnology (M.Sc.Eng.)
• alternative title: Optimering av syntes och stabilitet hos lipidnanopartiklar (LNP): Karakterisering av modellsystem och PolyA-laddade MC3-LNPs
• course: KLGM16 20251
• year: 2025
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences; Technology and Engineering
• keywords: Lipid Nanoparticles, Blebs, Fluorescence, Riboflavin, PolyA, DLS, AF4- UV/MALS/dRI, LC-CAD, Particle Size Distribution, Pharmaceutical Formulation
• language: English
• id: 9213172
• date added to LUP: 2025-10-21 15:28:06
• date last changed: 2025-10-21 15:28:06